p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致人神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

[背景]职业接触甲醇后可引起中枢神经系统损伤。有研究表明,在应激或毒性刺激下,钙激活蛋白酶(calpain)使p35蛋白转化为p25蛋白,激活钙依赖性蛋白激酶5(CDK5),p53蛋白积聚及磷酸化后出现神经细胞凋亡。甲醇是否可以激活calpain从而启动p25-CDK5-p53信号通路,通过经典线粒体途径使神经细胞凋亡,尚不明确。[目的]通过体外实验探究p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)凋亡中的作用。[方法]采用不同浓度甲醇(0、250、750、1250 mmol/L,即对照、低、中、高浓度组)分别染毒SK-N-SH细胞24 h后,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR技术检测calpain2、CDK5、p35、p25、p53 mRNA表达水平;Western blotting检测calpain2、CDK5、p25、p35、p53及p53磷酸化蛋白表达水平。[结果]对照组及甲醇低、中、高浓度组处理24 h后细胞凋亡率分别为(8.15±1.77)%、(12.06±0.71)%、(13.81±0.67)%、(19.88±2.40)%,组间差异有统计学意义(F=29.05,P<0.01)。各浓度组calpain2、CDK5、p25、p53 mRNA相对表达水平差异均有统计学意义(F=10.02、61.48、28.91、21.12,P<0.01),各浓度组p35 mRNA相对表达水平差异无统计学意义(F=0.96,P>0.05)。与对照组相比,甲醇低、中浓度组calpain2、CDK5、p25 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),甲醇中浓度组p53 mRNA相对表达水平升高(P<0.01),高浓度组calpain2、CDK5、p25、p53 mRNA相对表达水平升高(P<0.01)。各浓度组calpain2、CDK5、p35、p25、p53磷酸化蛋白、p53蛋白相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.29、17.60、35.02、35.92、93.72、11.00,P<0.05)。与对照组相比,低、中、高浓度组calpain2、CDK5、p35、p25、p53磷酸化蛋白相对表达水平升高(P<0.05),中、高浓度组p53蛋白相对表达水平升高(P<0.05),低浓度组p53蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]甲醇染毒后可使calpain2、p35、p25及CDK5蛋白表达水平增加,p53蛋白积聚及其磷酸化,和SK-N-SH神经细胞凋亡。

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α+5-氮杂胞苷组。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。

基于Calpain/p35-Cdk5/p25通路探究肾脑复元汤联合hUC-MSCs干预对缺氧缺糖神经元的保护作用

目的:基于Calpain/p35-Cdk5/p25通路探究肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)干预对缺氧缺糖神经元的保护作用。方法:原代培养神经元,并随机分为正常组、模型组(缺糖缺氧造模,OGD)、中药组(OGD+含中药血清)、干细胞组(OGD+h UC-MSCs共培养)、联合组(OGD+含中药血清+h UC-MSCs共培养)、抑制剂组(OGD+Calpain抑制剂),采用CCK-8法检测神经元活力,AO/EB染色观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Werstern blot法检测Cdk5、p25、p35的表达。结果:模型组神经元缺糖缺氧后,突起回缩,轴突网络稀释,细胞核变性、甚至碎裂,与正常组比较,细胞活力明显下降,大量细胞凋亡,Cdk5、p25表达明显上升,p35表达明显下降(P<0.01);与模型组比较,中药组、干细胞组、联合组及抑制剂组神经元活力升高,凋亡细胞数降低,Cdk5及p25表达下降,p35表达上升(P<0.05,P<0.01);与中药组、干细胞组及抑制剂组相比,联合组神经元活力升高、早凋细胞减少(P<0.05);联合组及抑制剂组CDK5、p25表达较中药组及干细胞组下降,p35表达较中药组及干细胞组上升(P<0.05)。结论:肾脑复元汤联合h UC-MSCs移植能显著改善缺糖缺氧神经元凋亡,其作用机制可能与调控Calpain/p35-Cdk5/p25通路有关。

五味子水提取液延缓叔丁基过氧化氢导致的SH-SY5Y细胞衰老研究

目的:探讨五味子水提取液(SWE)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞衰老的保护作用并探讨其机制。方法:将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组(叔丁基过氧化氢100μmol·L-1孵育12 h)和给药组(衰老处理后加不同浓度SWE);MTT法检测各组神经细胞的活力,检测乳酸脱氢酶释放量,RT-PCR法检测各组SH-SY5Y细胞中p53和p21 m RNA的表达。结果:与正常组比较,用不同浓度的t-BHP处理的SH-SY5Y细胞存活能力显著降低,并得到t-BHP诱导SH-SY5Y细胞衰老的最适条件为100μmol/L孵育12 h。与模型组比较,给予不同浓度的SWE能显著提高t-BHP损伤细胞的存活率,改善受损SH-SY5Y细胞的形态,降低LDH的释放量。给药组SH-SY5Y细胞的活力较模型组显著增强(P<0.01);LDH释放量显著降低(P<0.01);p53和p21 m RNA的表达明显降低(P<0.01),以500μg/m L效果最好。结论:SWE对t-BHP诱导的SH-SY5Y细胞衰老有明显的神经保护作用,这可能与抑制了p53-p21通路有关。

电针对阿尔茨海默病大鼠海马P35/P25-细胞周期素依赖性蛋白激酶5-Tau蛋白信号通路的影响

目的:通过观察电针对阿尔茨海默病(AD)大鼠P35/P25-细胞周期素依赖性蛋白激酶5(CDK5)-Tau蛋白信号通路的影响,探讨电针防治AD的机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组和治疗组,每组12只。采用双侧海马注射Aβ25-35复制AD大鼠模型。治疗组电针"百会"和双侧"肾俞"穴,每次15 min,每日1次,共10 d。用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,免疫组织化学法检测海马组织P35/P25、CDK5、Tau5蛋白分布及表达情况,Western blot法检测上述蛋白及Tau蛋白Ser199和Ser202位点的磷酸化表达水平。结果:在可视平台实验中,各组大鼠平均逃避潜伏期与搜索路径差异均无统计学意义(P>0.05)。在隐蔽平台实验中,与对照组比较,假手术组大鼠平均逃避潜伏期和搜索路径差异均无统计学意义(P>0.05);模型组平均逃避潜伏期和搜索路径较对照组、假手术组明显延长(P<0.05);与模型组比较,治疗组平均逃避潜伏期和搜索路径明显缩短(P<0.05)。在空间探索实验中,与对照组比较,假手术组穿越原平台次数差异无统计学意义(P>0.05);模型组穿越原平台的次数较对照组和假手术组显著减少(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,治疗组穿越原平台次数显著增加(P<0.05)。与对照组及假手术组比较,模型组P35/P25、CDK5蛋白表达均明显升高(P<0.001);治疗组P35/P25、CDK5蛋白表达较模型组明显降低(P<0.001)。各组间Tau5蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot法和免疫组织化学法的结果趋势一致。模型组大鼠海马区Tau蛋白Ser199和Ser202位点的磷酸化表达水平明显高于对照组和假手术组(P<0.01,P<0.05);治疗组Tau蛋白Ser199和Ser202位点的磷酸化表达水平较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:电针刺激可能通过影响大鼠海马区P35/P25-CDK5-Tau信号通路相关蛋白的表达变化,从而延缓AD的进展。

表没食子儿茶素没食子酸酯促进急性髓系白血病细胞凋亡的机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导CHD5基因去甲基化促进KG-1、THP-1细胞凋亡的相关机制。方法设实验组及正常对照组,实验组:不同浓度(25、50、75、100、150μg/mL)EGCG处理作用于KG-1、THP-1细胞,正常对照组:不加EGCG处理。MSP法检测KG-1、THP-1细胞CHD5基因甲基化;MTT法检测作用48 h后细胞增殖;流式细胞术检测作用48 h后细胞周期和细胞凋亡状况;RT-qPCR、Western blot检测DNMT1、CHD5、p19^Arf、p53、p21^Cip1基因和蛋白表达。结果EGCG呈现剂量依赖性逆转了KG-1、THP-1细胞CHD5基因高甲基化;EGCG以剂量依赖性的方式抑制KG-1、THP-1细胞增殖(P<0.05);EGCG诱导细胞周期停滞于G1期,促进细胞凋亡;EGCG以剂量依赖性的方式下调DNMT1的mRNA和蛋白表达,上调CHD5、p19^Arf、p53、p21^Cip1的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论EGCG可通过下调DNMT1降低KG-1、THP-1细胞CHD5基因高甲基化,恢复CHD5基因表达,从而上调p19^Arf、p53、p21^Cip1表达诱发细胞凋亡。