重组HSP65-6P277乳酸乳球菌疫苗对链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠的降糖作用

探讨表达HSP65-6P277蛋白的乳酸乳球菌活载体疫苗对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠的降糖作用及可能的作用机制。采用多次小剂量腹腔注射STZ建立1型糖尿病模型。将诱导型表达菌株Lactococcus lactis NZ9000pCYT∶HSP65-6P277和组成型表达菌株L.lactis NZ9000 pHJ∶HSP65-6P277及无关蛋白对照菌株L.lactis NZ9000 pCYT∶Nuc灌胃1型糖尿病小鼠(2×109CFU,200μL),每天灌胃1次,连续7 d,之后每周灌胃1次,持续16周。每月从小鼠眼眶静脉丛取血1次,血糖检测仪检测STZ造模小鼠血糖水平并称体重。4个月后将小鼠处死,取小鼠脾脏做脾细胞增殖实验,采用ELISA试剂盒分别检测脾细胞上清液中的IL-10和IFN-γ细胞因子水平以及血清IgG抗体水平。结果显示,与对照组相比,pCYT∶HSP65-6P277组和pHJ∶HSP65-6P277组可以一定程度上降低STZ造模小鼠血糖水平(P<0.05),并能维持其正常体重稳定,降低脾细胞针对HSP65和P277的增殖(P<0.05),脾细胞上清液中IFN-γ细胞因子水平明显降低(P<0.05),血清IgG抗体水平无明显差异(P>0.05)。

P277多肽的表达、纯化及初步药效学分析

通过PCR方法得到P277多肽基因,插入到含门冬酰胺酶C端第199~326氨基酸残基片段的后面,形成融合蛋白,中间预留酸水解位点,并在P277多肽和融合蛋白之间加入一段碱性序列,构建pET28AnsB-C-KR-P277高效表达载体。克隆的基因在大肠杆菌中高效表达,通过Triton X-100洗涤、乙醇分级沉淀纯化融合蛋白AnsB-C-KR-P277,酸水解后经等电点沉淀去除杂蛋白,再经阴离子交换柱层析,进一步分子筛脱盐,可得到纯化的目的多肽P277。这种多肽生产平台,为多肽生物合成提供了一个很好的方法。纯化后的P277免疫型糖尿病模型动物NOD(non-obese diabetic)小鼠,可明显降低NOD小鼠自发性糖尿病的产生。

抗Ⅰ型糖尿病融合基因HSP65-6×P277在烟草中的表达

为了研究抗Ⅰ型糖尿病融合蛋白质基因HSP65-6×P277在植物中的表达,构建了含有融合基因HSP65-6×P277的植物表达载体pCAMBIA2301-HSP65-6×P277,通过农杆菌介导法将重组载体转入烟草,利用卡那霉素作为植物筛选标记,获得含有抗Ⅰ型糖尿病基因的16株转基因烟草植株。通过PCR、半定量RT-PCR及SDS-PAGE蛋白质电泳等方法检测,初步验证在抗性烟草植株中融合基因HSP65-6×P277在mRNA和蛋白质水平上进行了表达。

鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277预防NOD小鼠1型糖尿病的发生(英文)

目的提高多肽p277的免疫原性,从而提高其对自身免疫性糖尿病的预防作用。方法将p2776次重复与Hsp65融合置于pET28a中构建重组Hsp65-6×p277表达质粒。该重组质粒在大肠杆菌BL21中以高效可溶形式表达。依次通过细胞裂解、硫酸铵沉淀、双蒸水透析、DEAE纤维素52柱层析纯化获得目的蛋白。用纯化后的融合蛋白Hsp65-6×p277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠。每月眼角取血,检测抗体和血糖浓度。结果初步药效学实验表明融合蛋白Hsp65-6×p277可抑制NOD小鼠中1型糖尿病的发生。结论融合蛋白Hsp65-6×p277有可能发展成为一种具有防治胰岛素依赖性糖尿病作用的疫苗。

L-天冬酰胺酶表面呈现对P277肽免疫原性及抗NOD小鼠糖尿病作用的影响(英文)

将P277多肽融合在L-天冬酰胺酶的C端,中间引入破伤毒素肽(TTP),重组嵌合酶AnsB-TTP-P277能以可溶性蛋白的形式表达于大肠杆菌周质内,且能保持大约80%的天然酶催化活力.用纯化的嵌合酶腹腔注射非肥胖性(NOD)小鼠,可成功诱导小鼠体内产生高水平抗P277抗体.研究表明,P277肽可呈现于L-天冬酰胺酶表面,有效地克服单独P277的弱免疫原性,激发机体产生较强烈的免疫反应.小鼠胰腺病理学切片也显示:重组嵌合酶AnsB-TTP-P277和单纯P277肽相比,能更有效地抑制NOD小鼠糖尿病的发生.

融合蛋白HSP65-6×P277在NOD鼠中降糖作用的机制研究(英文)

目的:探讨融合蛋白HSP65 -6×P277在NOD鼠中的降糖作用机制。方法:融合蛋白HSP65 -6×P277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠。观察该融合蛋白对NOD小鼠血糖,细胞因子水平,抗体类型和胰腺炎严重程度的影响。结果:融合蛋白HSP65 -6×P277免疫组动物血清中含有高水平的IL-4和低水平的IL-2 ,P277特异性抗体类型主要为IgGl和IgG2b,IgG2a水平较低;T细胞增殖实验的培养上清中含有较高水平的IL-10和较低水平的IFN-γ;胰腺炎的严重程度和1型糖尿病的发病率显著降低。结论:诱导了Th2免疫反应可能是HSP65-6×P277预防1型糖尿病发生的作用机制之一。

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a(+)中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。

基于PROFIBUS-DP的自动装配线控制系统设计

介绍基于西门子S7-300的Profibus-DP自动化控制系统设计方案及具体设置过程;利用MP277触摸屏对S7-300主从站PLC、变频器等组成的物料装配自动线进行控制,证实了设计的可行性和正确性,设计过程还可以作为Profibus-DP总线的典型培训案例。

一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。

更正

《中华糖尿病杂志》2019年4月第11卷第4期《糖尿病心肌损伤与酪蛋白激酶CK1ε参与调控的时钟基因Per2的关系》一文,因旧投稿系统更新当时此篇文章校对稿件未接收到,第一-作者黄琴现做如下更正:(1)P277左栏倒数第5行"美国Sigma公司"更正为"陶素生化(上海)";(2)P278右栏第6行"均值±标准差"更正为"x±se".