基于p30-gp90融合蛋白的禽网状内皮组织增生症病毒抗体间接ELISA方法的建立

禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)既可以诱发禽的肿瘤性疾病,又能引起感染禽群免疫抑制,给养禽业带来重大经济损失。REV抗体监测对于该病的诊断、预防和控制具有重要意义。本试验首先通过大肠杆菌表达系统表达了重组REV p30-gp90融合蛋白,随后建立了基于该融合蛋白的REV抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA),并对反应条件进行了优化。结果显示,p30-gp90间接ELISA的灵敏度(1:51200)是间接免疫荧光法(IFA)(1:6400)的8倍,与其他常见禽类病毒无交叉反应,且具有良好的批内和批间重复性。对从山东省部分地区养殖场采集的690份血清样品,同时利用p30-gp90间接ELISA和IFA进行检测,发现20.87%的血清样品经间接ELISA检测为阳性,间接ELISA和IFA的总体符合率为96.96%。结果表明,本研究建立的间接ELISA检测方法具有特异性强、敏感性高和重复性好的优势,为REV的快速诊断、流行病学调查和血清学监测提供了技术支持。

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的 构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法 根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列，自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点，用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段，插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞，于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果 从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因，构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒；ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ，减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ，得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论 从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因，并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒，诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析

利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白 ,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列 ,通过计算机分析 ,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET2 8a(+)内 ,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白 ,用已知的 6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清 ,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌 ,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 5 %。纯化获得了表达的融合蛋白 ,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体 ,用于临床及孕妇检测 ,对优生优育有较大意义。

非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备

为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。

非洲猪瘟病毒P30-54融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及反应原性研究

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

A30Pα-synuclein原核表达载体的构建及表达

目的构建A30Pα-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法酶切质粒pcDNA3.0-A30Pα-synuclein,获得A30Pα-synuclein基因的目的片段,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经考马斯亮蓝染色和Western-blot分析目的蛋白的表达。结果 A30Pα-synuclein基因克隆至pGEX-6P-1载体中,考马斯亮蓝染色及Western-blot检测到A30Pα-synuclein蛋白在BL21中的表达。结论成功构建A30Pα-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了A30Pα-synuclein融合蛋白,为进一步研究A30Pα-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好基础。

重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B在Hela细胞中表达的研究

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。

绵羊肺炎支原体Y98标准株P30外膜蛋白与IFN-γ的融合表达及其免疫原性

以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-γ重组蛋白的免疫保护率达到80%。间接ELISA试验证实,经100μL与200μL P30-IFN-γ重组蛋白免疫小鼠的血清中,P30抗体效价分别为1∶32 000与1∶64 000。以上结果证实,所制备的重组蛋白对小鼠实验个体基本安全,且P30-IFN-γ重组蛋白中的细胞因子IFN-γ组分可以调节机体免疫机能,增强P30蛋白的免疫保护效果。

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达(英文)

目的构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切、连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体,构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoⅠ和EcoRⅠ酶切的pET-30a(+)载体连接,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Western blot分析。结果从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。