小鼠胚胎心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶亚型p300调控心脏特异转录因子的动态表达

目的:观察小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的动态表达和这些基因的启动子区域组蛋白H3乙酰化修饰状态的变化,以及组蛋白乙酰化酶亚型p300对这些基因启动子的直接调控作用,为进一步研究先天性心脏疾病的发生机制奠定基础。方法:选取胎龄(Embryoday,E)10.5d和16.5d小鼠正常胚胎心脏,用实时荧光定量PCR(RealTimePCR)的方法观察上述基因mRNA的动态表达;采用染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP),用ChIP级抗乙酰化H3和抗p300抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用RealTimePCR扩增抗体所富集的上述基因启动子的DNA量,观察胚胎心脏发育过程中乙酰化组蛋白及组蛋白乙酰化酶亚型p300是否参与调控上述四种心脏特异转录因子的表达。结果:①胎龄E10.5d和E16.5d小鼠胚胎心脏的GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的mRNA表达水平都有明显差异(P<0.05),其中GATA4和MEF2C mRNA相对β-actin的表达水平,E10.5明显低于E16.5,而Nkx2.5和Tbx5mRNA相对表达水平,E10.5明显高于E16.5;并且ChIP结果显示这些基因启动子的乙酰化水平也随着时间而改变,但差异无统计学意义。②E10.5和E16.5胚胎小鼠心脏中,p300抗体均能免疫沉淀GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因启动子,其沉淀的基因量在这两个小鼠心脏发育的关键时间点有所不同,但差异无统计学意义。结论:小鼠胚胎心脏发育过程中,心脏发育相关基因GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5呈现动态表达,提示这些基因在心脏发育不同阶段具有重要作用。ChIP结果提示p300介导的组蛋白乙酰化修饰可能为调节这些基因动态表达的机制之一。

姜黄素对B-NHL细胞系Raji细胞转录共激活因子P300表达的抑制作用

目的探讨姜黄素对B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞转录共激活因子P300的影响及对Raji细胞的作用及其机制。方法以不同浓度的姜黄素作用于体外培养Raji细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,应用RT-PCR和蛋白印迹(W estern b lot)法检测Raji细胞中P300的表达。结果①姜黄素具有明显的抑制Raji细胞生长作用,并呈明显的量效关系。②姜黄素作用24 h后,随着浓度剂量的增加P300的mRNA和蛋白表达而逐渐降低。低剂量(6.25μmol.L-1)组P300表达有一定的降低,但与对照组相比差异无显著性(P>0.05),而中、高剂量(12.5、25及50μmol.L-1)则抑制P300的表达(P<0.05)。结论姜黄素对B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞具有抗肿瘤细胞的增殖作用,并呈浓度依赖性。姜黄素能够抑制转录共激活因子P300的表达,可能是其重要的机制。

转录共激活子p300及表观修饰在高糖致人系膜细胞代谢记忆中的汇聚作用

目的以人系膜细胞(HMCs)作为体外模拟代谢记忆的研究对象,观察转录共激活子p300及组蛋白乙酰化蛋白H3(Ac-H3)、Ac-H4的表达规律,并探讨p300在其中的潜在汇集点作用。方法将培养的HMCs按以下分组处理:①高糖诱导代谢记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)、渗透压组(LG,NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d),高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d)、记忆组(M1、M2、M3组,25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)、持续正糖组(NC,5.5mmol/L D-葡萄糖×9d)。②糖其化终产物记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);正糖+AGEs组(AGEs,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d);AGEs记忆组(AGEs-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);BSA组(NG+BSA,给予同浓度BSA对照)。③H2O2模拟氧化应激记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×30min);正糖+H2O2组(H2O2,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min);H2O2记忆组(H2O2-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);正糖对照组(NG3,5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。④蛋白激酶C(PKC)β2激活记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d);记忆组(M,25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);空载体记忆组(HN,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);PKCβ2激活记忆组(PO,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);PKCβ2抑制剂记忆组(PI,25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d)。采用二氢二氯荧光素(DCFDA)及酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的表达。Western blotting检测各组细胞p300、Ac-H3和Ac-H4及PKCβ2蛋白的表达水平。结果 HG组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达增加,分别较NG组增加了1.15倍、0.93倍和0.87倍(P<0.05),同时伴有PKCβ2蛋白及胞内ROS水平上调;M1、M2、M3组p300、Ac-H3、Ac-H4、PKCβ2蛋白水平及ROS表达水平与NG组比较仍显著升高,即使M3组亦较NG组分别增加75%、49%、47%、98%和48%(P<0.05)。AGEs组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调,较对照组分别升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P<0.05),AGE-M组各蛋白较对照组分别增加了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P<0.05)。H2O2组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达均升高,较对照组分别升高了1.03倍、0.85倍和0.79倍(P<0.05),而H2O2-M组各蛋白表达较对照组的差异无统计学意义。与M组比较,PO组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达进一步上调,分别为M组的1.25倍、1.06倍和1.10倍(P<0.05),选择性PKCβ2抑制剂CGP53353可以显著降低上述蛋白表达。结论 HMCs存在转录共激活子p300及表观修饰持续活化的记忆效应,p300可能系高糖致生化代谢及表观遗传记忆刺激的汇聚点。

曲古菌素A影响HL60细胞转录共激活因子P300表达的研究

目的观察曲古菌素A(TSA)对HL60细胞转录共激活因子P300的影响及对抑制HL60细胞增殖的分子机制。方法采用体外培养HL60细胞,以不同浓度TSA(50、100、200、300及400nmol/L)作用24h,以溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)法分析不同浓度TSA作用HL60细胞增殖活性的影响并以免疫组化、mRNA及免疫印迹(Westernblot)法检测HL60细胞中P300的表达。结果 TSA作用24h后,HL60细胞增殖活性随着浓度剂量的增加而逐渐降低;100、200、300、400nmol/LTSA处理HL60细胞24 h后,其P300 mRNA的吸光度值均低于对照组,差异有显著性(均P<0.05)。在Western blot检测显示P300吸光度值与对照组相比较,差异有显著性(均P<0.05);100、200、300nmol/L TSA处理HL60细胞24 h后,免疫组化结果显示P300的吸光度值与对照组比较,差异有显著性(均P<0.05)。低剂量(100nmol/L)组P300的表达与对照组相比无明显差异(均P>0.05),而中、高剂量200,300及400nmol/L组则抑制P300的表达(均P<0.05)。TSA作用下,HL60细胞P300的吸光度值与TSA的浓度呈负相关。结论 TSA能够抑制转录共激活因子P300的表达,而对HL60细胞具有抗肿瘤细胞的增殖作用,并呈浓度依赖性。

p300/CBP相关因子对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及机制研究

目的探讨p300/CBP相关因子(PCAF)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的作用及机制。方法组织块贴壁法获取大鼠原代VSMC,使用Ad-PCAF RNAi腺病毒转染VSMC以下调PCAF表达。选择1μg/ml的脂多糖作为VSMC迁移诱导剂。将实验分为4组:不添加脂多糖(对照组)、1μg/ml脂多糖刺激(A组)、Ad-绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(B组)、Ad-PCAF RNAi腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(C组)。采用Transwell实验检测细胞迁移水平。免疫荧光染色实验检测VSMC中NF-κB p65的核转位情况。Western blot检测PCAF、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,与对照组比较,A组和B组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与对照组比较,A组和B组穿出小室细胞数明显增多,差异有统计学意义[(766.30±40.86)个/视野、(794.00±76.36)个/视野vs (202.70±22.59)个/视野,P<0.05];与B组比较,C组穿出小室细胞数明显减少,差异有统计学意义[(337.00±82.95)个/视野vs (794.00±76.36)个/视野,P<0.05]。免疫荧光染色实验结果显示,与对照组比较,A组和B组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,C组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调PCAF的表达可明显抑制VSMC迁移,其机制可能与下调PCAF后抑制NF-κB信号通路介导的炎性反应有关。

缺氧诱导因子-1调控转录及相关转录抑制剂的研究进展

细胞低氧适应性反应可通过转录调节蛋白缺氧诱导因子 1 (HIF 1 )和p30 0 /CBP辅激动因子对低氧应答基因的转录激活介导。HIF 1是药学上重要的靶点 ,设计以HIF 1α/p30 0复合物为靶点的小分子转录抑制剂 ,可用于心脑血管疾病或肿瘤的治疗。本文就HIF 1α与p30 0的相互作用 ,以及氧依赖的特殊氨基酸羟化对HIF

microRNA 26b-5p靶向下调p300对人脐带间充质干细胞的增殖作用

目的探讨潜在microRNA靶向下调p300表达水平对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖的影响。方法通过双荧光素酶报告基因(Firefly/Renilla Luciferase)系统筛选出作用于p300 3'UTR的目标microRNA,mimic转染UC-MSCs后RT-q PCR检测miRNA表达水平的变化,Western blot检测p300蛋白水平变化,RT-q PCR和Western blot检测多潜能转录因子表达水平的变化,MTT法检测UC-MSCs增殖能力的变化,并比较克隆形成能力的差异。结果证实mir 26b-5p通过不完全互补配对结合p300的3'UTR区,显著降低了荧光素酶的相对活性(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后抑制p300蛋白表达水平(P<0.05),并下调Nanog基因和蛋白表达水平(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后UC-MSCs的增殖受到抑制(P<0.05),克隆形成能力下降(P<0.05)。结论 UC-MSCs高表达mir 26b-5p能够显著抑制p300蛋白表达和干性相关基因Nanog的表达,并且抑制UC-MSCs的增殖能力和克隆形成能力。

p300/CBP与肺癌

细胞核内DNA绝大多数时间缠绕并结合在组蛋白上，储藏在高度压缩的染色质中，处于非激活状态。细胞如需要激活一些基因，转录因子则协同将相关基因（DNA片段）从组蛋白上解离下来。其中一组转录因子家族为组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs），根据结构和活性可将其分为5个大家族：

P300/环腺苷酸效应元件结合蛋白及其生物学功能

转录共激活因子P300/环腺苷酸效应元件结合蛋白结合蛋白(CBP)因分别与腺病毒癌蛋白E1A及环腺苷酸效应元件结合蛋白相结合而得名。P300/CBP可影响细胞增殖、分化和程序性死亡等。本文就P300/CBP的结构、功能、作用机制以及对转录因子和细胞周期因子等的调控作用等研究进展作一综述。

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPb介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AD2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPb可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.

转录辅激活因子和乙酰基转移酶p300在心肌肥厚中的作用

心肌细胞中,p300是维持其分化表型所必须的转录辅激活因子。在心脏压力负荷增加等病理条件下,一些肥厚反应转录因子,如锌指蛋白GATA-4和肌细胞增强因子2(MEF2)等,可与p300相互作用,参与心肌细胞肥厚的病理过程。拮抗p300可有效阻断心肌肥厚的病理进程,进而改善心功能。更好地了解p300在心肌肥厚中的作用,对于未来治疗心肌肥厚和心力衰竭具有重要意义。

转录共激活因子OBF-1调节p300表达的初步研究

OBF-1是淋巴细胞特异性转录共激活因子,其蛋白主要有2种异构体分别为p34和p35。为观察OBF-1对p300基因表达的影响,分离OBF-1-/-小鼠的脾脏单个核细胞及B细胞,采用RT-PCR及Western blot方法分别检测p300 mRNA和蛋白水平。构建小鼠OBF-1(p34)表达质粒和p300报告基因质粒。在293T细胞中过表达p34,检测p34对内源性p300蛋白表达的影响。将p34表达质粒和p300报告基因质粒共同转染293T细胞,通过荧光素酶报告基因方法检测p34对p300基因启动子转录活性的影响。结果:与来源于OBF-1+/+小鼠的脾脏单个核细胞相比,来源于OBF-1-/-小鼠的单个核细胞中p300表达无论是mRNA还是蛋白水平均明显降低。分析显示,OBF-1(p34)能够促进p300基因转录及蛋白表达。这些结果提示,OBF-1正调p300转录及表达。

曲谷抑霉素A调控人干扰素调节因子3基因初步研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)曲谷抑霉素A(trichostain A,TSA)对人干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)基因表达的影响,初步分析TSA调控IRF3基因的乙酰化机制。方法:双荧光素酶活性分析法检测TSA和组蛋白乙酰化酶(histone acetylase,HAT)野生型p300对IRF3基因启动子活性的影响;实时荧光定量PCR检测TSA对IRF-3基因m RNA水平的影响;Western blot检测TSA对IRF3蛋白水平的影响。结果:不同浓度TSA干预后IRF3基因启动子活性均增加,TSA浓度为1μmol/L时,PS1、PS6相对荧光素酶活性分别增加75%、155%;过表达野生型p300后PS1相对荧光素酶活性增加267%;TSA(1、10μmol/L)干预细胞6 h后,IRF3基因m RNA水平增加23%、39%,干预24h后,m RNA水平增加17%、64%;TSA(0.1、1、5μmol/L)干预细胞24 h后,蛋白表达量分别增加15%、72%、191%。结论:TSA上调IRF3基因m RNA和蛋白表达,TSA和组蛋白乙酰化酶p300均可正向调控IRF3基因启动子活性,TSA可能通过IRF3通路发挥治疗免疫性疾病和抗肿瘤作用。

转录辅激活子p300/CBP的结构、功能及其在白细胞介素基因表达调控中的作用

p300/CBP(CREB binding protein,CBP)是多功能的转录辅激活子,它们参与细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程.p300/CBP具有乙酰转移酶活性,能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控.同时,它们能在转录因子和基本转录复合物之间起到桥梁作用,而且也能为整合多种转录辅因子提供支架.p300/CBP是肿瘤抑制子,在多种癌症中,都发现了p300/Cbp基因的突变或易位.另外,在多种神经退行性疾病中,p300/CBP的功能受到抑制可能是引起细胞毒性的根本原因.现已证明p300/CBP参与多种白细胞介素基因的表达调控.结合我们的研究结果,本文对p300/CBP 的结构、功能及其在白细胞介素基因表达调控中的作用进行评述.

赖氨酸乙酰转移酶2B与动脉粥样硬化关系的研究进展

心脑血管疾病是世界上造成死亡的主要原因,严重威胁人类生命健康。动脉粥样硬化（AS）包括心肌梗死和脑卒中在内的多种心脑血管疾病的病理基础。AS发病机制涉及多个方面,但越来越多研究表明,组蛋白乙酰化修饰介导的表观遗传调控在AS中扮演着重要的角色。

姜黄素通过抑制p300/CBP下调酒精诱导的胎鼠心脏GATA4及NKX2.5过表达

目的:探讨p300/CBP是否参与介导了孕期酒精暴露所致的心脏核心转录因子GATA4和NKX2.5的过表达,为防治酒精所致的先天性心脏病提供新的切入点。方法:选取C57BL/6小鼠作为研究对象,随机分为对照组、酒精组、DMSO+酒精组和姜黄素+酒精组。收集胚胎16.5d胎鼠心脏,采用染色质免疫共沉淀技术和Western blot检测小鼠心脏组织中GATA4、NKX2.5启动子区域p300/CBP的结合量及组蛋白ac-H3的乙酰化水平。运用RT-PCR检测GATA4、NKX2.5基因mRNA表达量。结果:ChIP-RT-PCR结果显示,酒精能够显著提高GATA4、NKX2.5启动子区域p300/CBP的结合量及组蛋白ac-H3的乙酰化水平(均P<0.01)。Western blot结果表明,酒精能够显著提高胎鼠心肌组蛋白ac-H3表达水平(P<0.01)。RT-PCR结果显示,酒精能够显著上调GATA4、NKX2.5基因mRNA表达量(均P<0.01)。姜黄素(p300/CBP抑制剂)能够显著降低GATA4和NKX2.5基因启动子区域p300/CBP的结合量,纠正酒精所致的组蛋白ac-H3的高乙酰化,并下调GATA4和NKX2.5基因mRNA过表达(均P<0.05)。结论:p300/CBP介导的组蛋白ac-H3高乙酰化可能是孕期酒精暴露致GATA4、NKX2.5基因过表达的关键调控因素。姜黄素通过抑制p300/CBP在启动子区域的结合能显著降低酒精所致的组蛋白H3高乙酰化,下调GATA4、NKX2.5基因过表达,可能成为防治孕期酒精暴露致子代心脏发育畸形的干预新靶点。

p300和HDAC3介导的可逆的乙酰化作用参与调控IL-18p1启动子荧光素酶报告基因活性

IL-18是调节先天性免疫和获得性免疫的重要细胞因子,在Th1的发育中起着重要作用.p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子.HDAC3是一种组蛋白去乙酰化酶.通过一系列共转染实验证实,p300能够刺激外源IL-18启动子活性,而HDAC3则抑制其活性.p300的乙酰化酶活性对于增强IL-18p1启动子荧光素酶报告基因激活是必需的.p300能提高转录因子c-Fos介导的IL-18启动子荧光素酶报告基因的活性,这种作用能被HDAC3抑制.p300对于内源IL-18mRNA合成有增强作用.首次证实了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶参与IL-18p1启动子活性的调控,为进一步研究IL-18基因表达调控的机制奠定基础.

转录因子GATA的乙酰化

在对心脏肥大或心肌增厚的反应中，诸如GATA-4类转录因子可诱发某些蛋白质的表达，这些蛋白质能增加细胞的体积，提高心肌收缩强度和血管收缩作用。GATA-4可通过其辅激活剂p300而被乙酰化进而启动其功能。但是，在本文发表之前，人们还不清楚接受乙酰化标签的确切氨基酸残基。本文作者对GATA-4的两个富赖氨酸结构区段进行了突变分析，