上皮细胞转化序列2通过调控p33生长抑制因子1表达影响食管鳞状细胞癌细胞的体外转移活性

目的探讨上皮细胞转化序列2(ECT2)与p33生长抑制因子1(p33ING1)的表达水平对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞转移活性的影响。方法采用免疫组织化学法和免疫印迹法检测食管鳞癌组织和癌旁组织中ECT2和p33ING1的表达情况。将人食管鳞癌细胞系KYSE140细胞分为4组:空白组、阴性对照组(pcDNA 3.1 NC)组、过表达组(pcDNA 3.1 ECT2)和抑制表达组(si ECT2)。采用MTT法和细胞集落形成实验研究细胞的增殖和生长能力,Transwell实验和划痕实验研究细胞的侵袭和迁移能力,并用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测ECT2对p33ING1蛋白的影响。结果在食管鳞癌组织中ECT2表达增加,p33ING1表达降低。过表达ECT2能够显著增加KYSE140细胞的生长、集落形成、迁移以及侵袭能力,并能降低KYSE140细胞的凋亡率和p33ING1的表达;此外,抑制ECT2表达后能够逆转上述变化。结论ECT2高表达能够促进食管鳞癌KYSE140细胞的生长、转移,并抑制其凋亡,其机制可能与ECT2能够抑制p33ING1表达相关。

牛支原体贵州分离株P33基因的克隆及遗传进化分析

为了解牛支原体贵州分离株的遗传进化情况,对其P33基因进行PCR扩增,扩增产物克隆至pMD19-T载体,筛选阳性克隆质粒进行基因序列和同源性分析,构建遗传进化树。结果:牛支原体贵州株P33基因PCR产物长度约690 bp(命名为GZ-Mb),与湖北株HB0801、Hubei-1同源性为99.6%,且在同一进化分支。结论:牛支原体贵州株P33基因与湖北株同源性最高,亲缘关系最近。

胰腺癌中p33^(ING1b)基因变化及其表达研究

目的 检测胰腺癌中p33ING1b蛋白表达及基因变化情况,以了解p33ING1b在肿瘤发生过程中的作用。方法 采用免疫组化、聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCR SSCP)和杂合型缺失(LOH)技术,检测胰腺癌中p33ING1b表达及p33ING1b基因变化情况。结果 ING1b蛋白的阳性表达率为85% (34/40),SSCP显示在40例病例中仅1例突变,LOH率为60.9% (14/23)。结论 突变与缺失表达并不是p33ING1b的主要失活形式,染色体改变可能导致p33ING1b功能下降,从而引发肿瘤发生。

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析吉林省流行的牛瑟氏泰勒虫基因序列,根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计合成一对引物,用PCR方法扩增出牛瑟氏泰勒虫的基因片段,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上,将经EcoRⅠ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果表明克隆的基因片段长度为868bp,编码283个氨基酸,有2个潜在的糖基化位点。核苷酸同源性分析表明,该基因片段与韩国株(AF521557)、日本株(AB016280)、俄罗斯株(AB016279)的核苷酸序列同源性分别为99.4%、88.0%、88.1%。

P33^(ING1)在胃癌组织中的表达及其意义

目的 :探讨 P33ING1表达在胃癌发生、发展过程中的病理生物学及临床意义。方法 :应用免疫组化 En Vision法 ,分别检测了原发性胃癌 (71例 )、胃粘膜不典型增生 (12例 )、正常胃粘膜或慢性胃炎粘膜 (18例 )组织中 P33ING1的表达 ,以及 P5 3和Bcl- 2在胃癌组织中的表达情况。结果 :胃粘膜不典型增生组及对照组 (正常胃粘膜或慢性胃炎粘膜 ) P33ING1均呈阳性表达 ,胃癌组织 P33ING1表达率仅为 6 2 .0 % (4 4/ 71) ,显著低于前两组 (P<0 .0 1)。胃癌组织中 P33ING1表达与肿瘤的浸润、淋巴结的转移及分化有关 (P<0 .0 1) ;P5 3表达与肿瘤大小、浸润、淋巴结转移有关 (P<0 .0 1) ;Bcl- 2与肿瘤的淋巴结转移及分化有关 (P<0 .0 5 )。 P33ING1 与 P5 3在胃癌组织中的表达有相关性 (P<0 .0 5 ) ,与 Bcl- 2则无相关性。结论 :P33ING1 在胃癌组织中表达下降 ,对胃癌发生、发展可能起重要作用。同时检测 P33ING1 与 P5 3的表达水平 。

牛瑟氏泰勒虫P33-P23核酸疫苗研究

根据牛瑟氏泰勒虫主要表面蛋白基因p23和p33的已知序列,设计特异性引物,将克隆产物与pVAX1表达载体连接,得到真核重组表达质粒pVAX1-p33-p23,脂质体介导其转染Hela细胞后进行表达产物的鉴定,最后进行BALB/c小鼠免疫试验。结果,目的基因在真核细胞内得到正确表达,动物免疫试验pVAX1-p33-p23核酸疫苗能够提高小鼠的细胞免疫和体液免疫水平,并且pVAX1-p33-p23免疫组的免疫效果均高于pVAX1-P33和pVAX1-P23免疫组(P<0.05)。从而证明,牛瑟氏泰勒虫的重组pVAX1-p33-p23核酸疫苗成功构建。

p33^(ING1b)增强骨肉瘤细胞U2OS对足叶乙甙的敏感性

背景与目的:作为一个新的抑癌基因,ING1与p53有许多相似的生物学功能,如细胞生长抑制、DNA修复、凋亡和化疗敏感性等。本实验目的在于研究p33ING1b对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响并探讨其作用机制。方法:瞬时转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,用足叶乙甙(etoposide,VP-16)处理24h,然后采用台盼蓝拒染法计数活细胞数并计算细胞生长抑制率,流式细胞仪、DAPI染色等方法检测细胞凋亡率,Westernblot技术检测p53、p21WAF1、MDM2和Bax蛋白的表达。结果:台盼蓝染色结果表明,瞬时转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,再用VP-16处理24h,细胞生长抑制率明显增加(63.1±5.1)%。流式细胞计数和DAPI染色检测结果表明,细胞凋亡率明显增加(62.7%)。Westernblot检测结果显示,外源性p33ING1b高表达明显提高了p53及其下游基因p21WAF1和Bax蛋白的表达水平,转染p33ING1b进入骨肉瘤细胞株U2OS后,再用VP-16处理24h,p53、p21和Bax蛋白表达增加。在各实验组中,MDM2的蛋白表达没有明显变化。结论:p33ING1b能够上调p53蛋白,并上调p53下游因子——p21WAF1和Bax的表达水平,通过p53依赖性凋亡信号通路,提高骨肉瘤细胞U2OS对VP-16的敏感性。

牛瑟氏泰勒虫P23和P33表面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达

为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker(Gly4Ser)3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70.0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。

食管癌发生发展过程中P33/ING1、Survivin蛋白的表达

目的 :探讨食管癌发生发展过程中P33/ING1、Survivin蛋白的表达及其与食管癌病理特征的关系。方法 :采用免疫组化SP法检测P33/ING1、Survivin蛋白在 6 0例食管癌手术后大体标本中食管正常黏膜、单纯增生、不典型增生、原位癌及浸润癌组织的表达。结果 :P33/ING1蛋白从正常黏膜→单纯增生→不典型增生→原位癌→浸润癌呈渐进性低表达 ,而Survivin蛋白则呈渐进性高表达。正常黏膜与不典型增生、原位癌及浸润癌中P33/ING1、Survivin蛋白的表达差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;P33/ING1蛋白表达情况与食管癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关 (P <0 .0 5 )。食管浸润癌组织中P33/ING1蛋白的低表达与Survivin蛋白的高表达呈负相关 (r =- 0 .4 80 ,P <0 .0 1 )。结论 :P33/ING1、Survivin 2种蛋白与食管癌的发生发展密切相关 。

以P33重组蛋白为诊断抗原建立牛瑟氏泰勒虫病乳胶凝集试验

本试验用P33重组蛋白建立了牛瑟氏泰勒虫病乳胶凝集试验。对81份被检血清的检测结果,阳性率为44.4%,明显高于血涂片镜检法的21.0%(P<0.01),而且在该病流行地区的不同牧场、不同性别和不同年龄牛的阳性率之间未见显著差异。试验表明,以P33重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、抗原易纯化和成本低等优点。

非小细胞肺癌中p33^(ING1b)表达的临床及生物学意义

目的:探讨p33ING1b的表达与非小细胞肺癌(Non-smallCellLungCarcinoma,NSCLC)临床病理特征的关系及其在NSCLC发生、发展中的可能作用机制。方法:用免疫组化SP法检测NSCLC和非肿瘤肺组织中p33ING1b的表达及NSCLC组织p21WAF1和Bax中的表达。结果:p33ING1b在NSCLC组织中表达率显著低于非肿瘤肺组织(P<0.01)。p33ING1b低表达与肺癌的分化、分期及淋巴结转移有关。p33ING1b的表达率在低分化组(30.77%)显著低于高分化组(80.95%)、中分化组(71.43%)(P均<0.05)。在Ⅲ期和有淋巴结转移组的表达率显著低于Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移组(P均<0.01)。p33ING1b与p21WAF1表达呈正相关(P<0.01)。结论:1)p33ING1b在NSCLC中低表达,它的低表达对判断NSCLC恶性程度、浸润甚至转移有重要价值。2)p33ING1b的低表达使p21WAF1下调在NSCLC发生、发展中可能起重要作用。

p33ING1b和p53在银屑病和基底细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨肿瘤抑制因子p53和生长抑制因子p33ING1b在人类银屑病和基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)中的表达情况及临床意义。方法 :采用免疫组织化学Envision方法检测p53和p33ING1b在36例寻常型银屑病皮损(银屑病组)、28例BCC皮损(BCC组)和14例正常表皮(正常对照组)中的蛋白表达。结果:p53在正常对照组、银屑病组和BCC组中表达递增,p33ING1b在3组中表达递减,组间比较差异均有显著性(均P<0.05)。银屑病组和BCC组中,p53与p33ING1b之间均存在显著正相关(均P<0.05)。结论:p53和p33ING1b协同作用于增生性皮肤病的局部皮损,是细胞异常增殖的重要机制之一。

牛瑟氏泰勒虫双拷贝p33表面蛋白基因在原核细胞中的串联表达

为串联融合表达牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)p33表面蛋白,本研究根据GenBank中登录的T.sergenti p33基因序列(D87198),在去掉信号肽的部分设计两对引物。PCR扩增出两段相同的p33基因(p331、p332),大小均为684bp,并将两个基因片段按顺序依次插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建pGEX-p331-p332(2p33)。将pGEX-2p33重组质粒转化E.coli BL21中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示,该融合蛋白获得了高效表达,分子量约为80ku,表达产物以包涵体的形式存在。Western blot试验表明,融合蛋白可被T.sergenti阳性血清识别,具有较好的反应原性。该蛋白的串联融合表达为T.sergenti新型疫苗的研究奠定了基础。

散发性结直肠癌组织p33ING1b启动子甲基化情况及其意义

目的检测散发性结直肠癌组织p33ING1b启动子甲基化情况,探讨p33ING1b在散发性结直肠癌中转录抑制的可能机制。方法选择2008年10月—2012年3月在广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科住院的散发性结直肠癌患者63例,收集其癌组织及相应癌旁组织切除标本;同时选择在我院行吻合器痔上黏膜环切术(PPH)患者13例,收集其术后痔上黏膜组织。采用巢式-甲基化特异性PCR(nMSP法)检测p33ING1b启动子甲基化情况,RT-PCR检测癌组织p33ING1b mRNA表达水平;采用5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)对人结直肠癌细胞株DLD-1、Caco-2进行去甲基化干预实验。结果癌组织p33ING1b启动子甲基化阳性率为82.5%(52/63),癌旁组织为34.2%(27/63),痔上黏膜组织未检测出p33ING1b启动子甲基化,癌组织p33ING1b启动子甲基化阳性率高于癌旁组织和痔上黏膜组织(χ2=21.21,P<0.001;χ2=33.98,P<0.001)。不同性别、年龄、肿瘤位置、分化程度及有无淋巴结转移、远处转移患者癌组织p33ING1b启动子甲基化阳性率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);不同Dukes分期患者癌组织p33ING1b启动子甲基化阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。p33ING1b启动子甲基化癌组织p33ING1b mRNA相对表达量为(0.62±0.15),低于p33ING1b启动子非甲基化癌组织的(0.75±0.17)(t=2.553,P<0.05)。5-aza-dC干预后,人结直肠癌细胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b启动子甲基化均被逆转,且p33ING1b mRNA相对表达量较干预前升高(P<0.05)。结论 p33ING1b启动子甲基化与散发性结直肠癌存在关联,并可能通过抑制p33ING1b mRNA的表达参与结直肠癌的发生和发展。

正反p33^(ING1b)对人类胰腺癌细胞SW1990生长的影响

目的:探讨p33ING1b和wtp53体外对胰腺癌细胞生物学活性的影响。方法:脂质体法将正义和反义p33ING1b以及wtp53单转染和共转染胰腺癌细胞SW1990;Western印迹法检测p33ING1b和wtp53蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期改变情况;特殊染色观察细胞凋亡情况。结果:转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者蛋白水平明显较反义组和空转组高(P<0.05);共转组SW1990细胞生长周期较其他各组缩短;转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者凋亡细胞数目较反义组和空转组多。结论:p33ING1b对细胞可能存在正性调控作用,这种作用可能主要通过p53来发挥作用的。

p33^(ING1b)对鼻咽癌细胞HNE1增殖的影响

背景与目的:作为ING1的一种主要表达产物,p33ING1b蛋白结合和稳定p53后诱导肿瘤细胞周期阻断或引起细胞凋亡。本研究通过建立高表达p33ING1b的鼻咽癌细胞HNE1模型,探讨p33ING1b对鼻咽癌细胞增殖影响及分子作用机制。方法:利用脂质体介导转染HNE1细胞,RT-PCR法筛选p33ING1b高表达的阳性克隆,绘制生长曲线检测细胞增殖速度,免疫组化法检测细胞中p53的表达分布,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测p53、p21、Stat3、C-myc和Cyclin D1蛋白水平。结果:转染ING1后p33ING1b表达水平显著升高,HNE1细胞增殖能力受到抑制,出现G0/G1期的阻滞、S期比例下降。细胞中Stat3、C-myc和CyclinD1表达水平显著降低,p53与p21表达水平上升。结论:p33ING1b可能通过促进HNE1细胞中p53和阻断Stat3两种不同信号传导通路抑制鼻咽癌细胞的增殖。

C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鳞状细胞癌中的表达和意义

目的研究C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鳞癌中的表达与临床病理特点的关系。方法采用荧光定量PCR法检测60例食管鳞癌患者的食管鳞癌组织、癌旁组织和正常食管组织中c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1的表达水平。分析它们在食管鳞癌浸润、分化、转移时表达的差异性及其相关性。结果 C-myc和P-gp/MDR1在正常食管组织、癌旁组织、食管鳞癌组织中的表达逐渐升高(P<0.05)。PTEN和p33/ING1在正常食管组织、癌旁组织、食管鳞癌组织中的表达逐渐降低(P<0.05)。C-myc在有淋巴结转移、低分化、浸润深的食管鳞癌组织中的表达高,差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN和p33/ING1在有淋巴结转移、低分化、浸润深的食管鳞癌组织中的表达低,差异有统计学意义(P<0.05)。P-gp/MDR1的阳性表达与食管鳞癌组织的分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移差异无统计学意义(P>0.05)。结论 C-myc和PTEN的协同作用共同参与了食管鳞癌的发展、浸润和转移。联合检测癌基因c-myc、抑癌基因PTEN,p33/ING1和P-gp/MDR1基因在食管鳞癌组织中的表达可能为临床诊断病情发展程度、化疗治疗疗效、预后等提供指导意义。

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与原核表达

本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因设计1对引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫全血基因组DNA,PCR扩增得到了大小为786 bp的基因片断,测序分析证明,它与已报道序列的核苷酸同源性可达99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了含有目的基因片段的重组表达载体pET-28a-P33。将此质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因在大肠杆菌中用IPTG诱导4 h时表达量达到高峰,表达产物为分子质量约30.3 ku的融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的43%,以包涵体形式存在;Western blotting试验证明,表达蛋白P33可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性。

大肠癌中抑癌基因p33/ING1 mRNA的表达及意义

目的 了解p33/ING1表达与大肠癌临床病理特征的关系及其可能作用机制。方法 采用逆转录PCR检测 5 2例散发性大肠癌癌组织及正常大肠粘膜中ING1的表达。结果 在大肠癌组织中p33/ING1mRNA表达较正常粘膜明显减弱 ( 30 /5 2 ,5 7.7% ) ,p33/ING1的低表达与肿瘤的Duke’s分期及淋巴结转移显著相关。

奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析

研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成1对引物,用PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段,将该基因纯化后连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析,并用此方法对延边某奶牛场10头奶牛进行了检测。结果表明:10份样品中9份为阳性,所扩增的目的基因核苷酸长为868bp,共编码283个氨基酸;该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸序列同源性为99·4%,氨基酸同源性为99·3%。