非洲猪瘟病毒无标签p35蛋白的制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10000,阴性和阳性判定阈值OD450为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的ASFV无标签p35蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于ASFV抗体的检测,为该病的进一步精准检测提供了技术手段。

IL-35亚基EBI3、P35对系统性硬化症小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响

目的:研究白细胞介素(IL)-35亚基对系统性硬化症(SSc)小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响。方法:将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、SSc模型组、SSc+EB病毒诱导的基因3抗体(SSc+EBI3 mAb)组和SSc+IL-12A P35抗体(SSc+P35 mAb)组,除正常对照组外,其余各组小鼠注射博来霉素构建SSc模型。造模后,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35mAb组分别腹腔注射100μL的EBI3 mAb、P35 mAb。采用苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠皮肤和肺组织炎症病理改变,Masson染色观察肺纤维化程度,免疫组化法检测皮肤和肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-35、IL-6、IL-10水平。结果:与对照组相比,SSc模型组小鼠皮肤厚度增加,肺纤维化评分、皮肤和肺组织炎症评分、血清IL-35水平及皮肤和肺组织α-SMA表达水平均升高,血清IL-10水平降低(均P<0.05)。与SSc模型组比较,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35 mAb组小鼠皮肤厚度增加,血清IL-10水平及皮肤、肺组织α-SMA表达水平升高,血清IL-35水平降低(均P<0.05);SSc+P35 mAb组小鼠肺纤维化评分较SSc模型组升高(P<0.05)。与SSc+EBI3 mAb组相比,SSc+P35 mAb组小鼠血清IL-10水平升高(P<0.05)。结论:IL-35可能通过EBI3和P35亚基抑制SSc小鼠模型皮肤和肺部的纤维化病变,而对炎症无明显作用,P35亚基在肺纤维化中的作用更明显。

美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

对美国白蛾核型多角体病毒 (HycuNPV ,Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)p35基因的序列分析表明 :HycuNPVp35编码序列 90 0bp ,编码 2 99氨基酸。同源性分析表明 :HycuNPVp35与BomoNPVT3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为 99 9%、 95 7%、 93 6 %、 80 2 %和 87 2 % ,在氨基酸水平上为 99 7%、 90 3%、 77%、 6 4 9%和 73 2 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPVT3中位的H1 2 2 ,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPVp35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPVT3p35蛋白的相似。

p35基因对MnCl_2诱导PC12细胞凋亡的作用

目的:探讨p35基因对氯化锰(MnCl2)诱导的PC12细胞凋亡的作用。方法:将p35基因转染PC12细胞得到可稳定表达p35基因的PC12/p35细胞株,使用相差显微镜观察、MTT染色和流式细胞分析等方法检测p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞凋亡的作用。结果:p35基因在PC12细胞中的稳定表达可以有效地抑制MnCl2诱导的PC12细胞凋亡。结论:p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞具有保护作用。

放射性脑损伤大鼠海马神经元P35及P25的表达

目的建立放射性脑损伤大鼠模型并观察P35、P25蛋白的表达情况。方法120只雄性SD大鼠随机分为单次全脑照射0、10、20、30 Gy 4个组。构建大鼠的放射性损伤模型,尼氏染色观察各组大鼠海马CAl区神经元的数目。组织匀浆法提取海马蛋白,Western blot法检测海马区P35、P25蛋白的表达。结果与0 Gy组比较,10 Gy组神经细胞死亡、P35及P25表达差异不明显(P>0.05);20、30 Gy组存活神经元减少,P35表达减少,P25表达增加(P<0.05)。结论放射性损伤可导致海马区神经元损伤,可能与P35和P25蛋白表达变化有关。

完整弓形虫P35重组蛋白IgM-酶联免疫吸附测定法检测弓形虫急性感染

为利用重组的完整弓形虫表面抗原P35 GST蛋白对弓形虫感染进行血清学诊断 ,构建了可表达P35 GST的JM10 9细胞株 .采用亲和层析对融合蛋白进行分离和纯化 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblot)分析所表达的蛋白质 ,并用纯化的重组蛋白进行IgM 酶联免疫吸附测定法 (IgM ELISA)检测不同病人血清中的抗 P35抗体 .SDS PAGE分析发现P35 GST重组蛋白的大小约 6 0ku ,为一亲水性蛋白 ,蛋白质印迹分析表明该蛋白与弓形虫阳性感染病人的血清有特异性反应 .利用P35 GST为抗原 ,对 6 0例血清进行IgM ELISA分析 ,发现P35 GST可明显区分近期感染和既往感染 ,在弓形虫的诊断上有很大的应用前景 .

寻常性银屑病皮损及非皮损中IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA的表达

目的检测寻常性银屑病患者皮损及非皮损处IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA表达,探讨其临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测寻常性银屑病患者皮损、非皮损处及正常人皮肤中IL-23(p19/p40)和IL-12(p35/p40)mRNA的表达水平。结果寻常性银屑病患者皮损中IL-23p19及p40(IL-23/IL-12)mRNA的表达均高于非皮损组织和正常皮肤组织(P<0.05),且非皮损处高于正常对照组,差异有显著性(P<0.05);IL-12p35mRNA在银屑病皮损处、非皮损处和正常对照中表达水平差异无显著性(P>0.05)。结论在寻常性银屑病发病过程中,IL-23可能发挥较IL-12更重要的作用。

X线照射原代培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及Cdk5激酶活性变化

目的研究X线照射培养大鼠海马神经元后p35,p25的表达及Cdk5激酶活性变化,为放射性脑损伤的预防和治疗提供理论依据。方法30GyX射线单次照射培养至12d的海马神经元,用Western-blotting检测Cdk5的激活蛋白p35、p25的水平,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况。结果p35蛋白水平在照射后3.5和4h分别比对照组升高(1.51±0.13)、(1.45±0.14)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);p25蛋白水平在照射后6h比对照组升高(1.62±0.28)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。30Gy组在照射后24h核固缩百分数为(24.8±3.97)%,与对照组(1.82%±1.08%)有显著性差异(P<0.01);30Gy+roscovitine组在照射后24h核固缩百分数为(7.74±2.27)%,与对照组有显著性差异(P<0.01)。结论X线照射培养海马神经元后p35、p25蛋白表达增加,激活cdk5;应用Cdk5抑制剂roscovitine抑制Cdk5活性可以显著减少神经元的凋亡。

CRISPR/Cas9建立IL-12p35基因敲除大鼠C6细胞系表达研究

目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除大鼠C6细胞系的IL-12p35基因,构建IL-12p35基因稳定敲除细胞株。方法:构建Lenti-sgRNA-EGFP质粒CRISPR/Cas9系统的Cas9核酸内切酶基因,慢病毒感染C6细胞后进行MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]检测及PI-FACS(Facial Action Coding System)细胞周期检测。结果:针对IL-12p35基因的KO1、KO2、KO3三个靶点,进行慢病毒转染,转染效率均大于80%。酶切前后靶点活性均下调,免疫印迹验证C6细胞中靶点有效性。MTT检测结果IL-12p35基因敲除后于第5天细胞增殖倍数明显降低。IL-12p35基因敲除后显著影响细胞周期G1期,G2/M期。结论:本研究构建IL-12p35基因的CRISPR/Cas9敲除系统,获得稳定的IL-12p35基因敲除细胞株,为后期IL-12p35与胶质瘤细胞的发生、发展机制方面研究提供基础。

弓形虫p35蛋白的基因克隆及其分子特征

目的 探讨 p35蛋白作为一个鉴别急性感染的诊断抗原和疫苗候选的应用价值。 方法 从弓形虫RH株分离总的RNA ,应用弓形虫EST基因库合成扩增p35基因片段引物 ,结合 5‘和 3‘末端cDNA快速扩增法进行 p35基因 5‘和 3‘末端cDNA的扩增 ,TA克隆RT -PCR产物及DNA顺序分析 ;用蛋白质分析软件解析 p35基因编码的氨基酸的亲水性和可能存在的T、B细胞的表位。结果 p35基因含有 15 37个碱基 ,编码 378个氨基酸 ,其氨基酸的亲水性区域分布在氨基酸的 2 0 1到2 2 5和 30 1到 340号 ,且含有多个T、B细胞的表位。结论 p35蛋白的C端区有高的亲水性 ,并含有T、B细胞的表位 ,显示了p35蛋白应用于诊断和疫苗开发的可行性。

棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的表达

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ Ａｃ Ｎ Ｐ Ｖ） 凋亡抑制基因ｐ３５ 的合成引物，从棉铃虫核型多角体病毒（ Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ） 基因组中用 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增到了１ｋｂ 片段。采用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 双脱氧核苷酸链终止银染法，测定了所扩增到的１ ０１０ｂｐ 全序列，发现其开放阅读框完整，长８９７ｂｐ ，编码２９９ 个氨基酸。用 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ 和 Ｐ Ｒ Ｏ Ｓ Ｉ Ｓ 软件分析发现，此片段与 Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ ｐ３５ 基因同源区核苷酸同源性为９１ ％ ，氨基酸同源性也达８１ ％ ，证明了所扩增的片段是 Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ 的ｐ３５ 基因。为了研究此ｐ３５ 基因的功能及其效应机制，克隆了这一基因并在大肠杆菌细胞中实现了表达。

Cdk5及p35在NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨Cdk5及p35在神经生长因子(NGF)撤退诱导的PC12细胞凋亡中的作用机制。方法:建立NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡模型,Western blotting检测Cdk5及p35在凋亡过程中表达变化情况,利用Cdk5特异性抑制剂Roscovitine预处理已分化PC12细胞,检测其对NGF撤退诱导的凋亡作用影响,向已分化PC12细胞转染真核表达质粒pCMV-p35-IRES-Cdk5,检测过表达Cdk5/p35对PC12细胞凋亡的影响。结果:NGF撤退36h会引起已分化PC12细胞出现典型的DNA Ladder凋亡特征,MTT检测结果也显示,NGF撤退对PC12细胞的损伤呈时间依赖性;Roscovitine预处理已分化PC12细胞可以抑制NGF撤退诱导的细胞凋亡率,但不影响Cdk5/p35蛋白表达水平;向已分化PC12细胞中转染真核表达质粒后,能检测到Cdk5/p35蛋白的过表达,并引起PC12细胞出现凋亡样改变。结论:Cdk5及p35的活化与NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡过程密切相关,抑制Cdk5的活化有抑制细胞凋亡保护神经元的作用。

小鼠神经细胞cdc2类蛋白激酶调节亚基p35^(Nck5a)基因的克隆和鉴定

目的： 获取小鼠神经细胞ｃｄｃ２ 类激酶（Ｎｃｌｋ）调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ，用于构建基因重复性打靶载体。方法： 用噬斑原位杂交法从λＰＳ基因文库中克隆小鼠ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因；用限制性内切酶酶切图谱分析和序列测定进行基因组结构分析。结果： 获得较完整的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ酶切图谱；该基因由一个外显子组成，长９２４ ｂｐ，编码３０７ 个氨基酸的蛋白质，内含子长２０８ ｂｐ，位于５′端侧翼序列中。测定的序列（－ １ ０８０ 至＋ ９２４ ｂｐ 和＋ ３ ７２１至＋ ４ ２２２ ｂｐ）与已报道的序列基本一致，仅在－ １３５和－ ２９５位各插入一个碱基Ｇ。结论： 得到的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ 片段长约１１ ｋｂ， 其５′端侧翼序列含有一些已知的调控序列，３′端含有ｐｏｌｙ Ａ 的信号序列。

大鼠三叉神经节中的Cdk5/p35

目的 检验Cdk5 / p35在神经元成熟和萌芽中起着重要作用的假说。 方法 采用Westernblot实验、免疫沉降和Cdk5活性分析的方法 ,研究出生后各阶段大鼠三叉神经节中该激酶的活性变化和Cdk5、p35的表达水平。结果 随着大鼠三叉神经节的发育 ,Cdk5的活性逐渐增加。新生大鼠三叉神经节中的Cdk5活性比成体正常大鼠三叉神经节中的Cdk5活性高约六倍。这一激酶活性的变化与 p35表达的变化是一致的。Cdk5的表达量在各阶段中是恒定不变的。结论 结果提示了Cdk5 / p35与神经元的分化。

p35^(Nck5a)基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复，采用常规的分子克隆技术，构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆，细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定，２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复，同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。

棉铃虫核型多角体病毒凋亡抑制基因对p35基因失活病毒的功能拯救

野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）能感染棉铃虫细胞，不引起细胞凋亡，用ＬａｃＺ基因使ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５插入失活，得到缺陷病毒Ａｃｐ３５Ｚ能迅速引起棉铃虫细胞凋亡，但缺陷病毒本身不能复制。用ＡｃＮＰＶ即早期基因ＩＥ１启动子带动棉铃虫杆状病毒（ＨａＮＰＶ）ｐ３５基因在棉铃虫细胞中瞬时表达，能拯救ｐ３５基因失活病毒Ａｃｐ３５Ｚ复制。通过Ｘ－ｇａｌ显色反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ分别检测到了半乳糖苷酶的活性和ｐ３５基因的表达，证明了所克隆的ＨａＮＰＶｐ３５基因不仅是一个凋亡抑制基因，也是一个与杆状病毒复制相关的基因，它的瞬时表达能支持Ａｃｐ３５Ｚ在棉铃虫细胞中复制。

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫RH株表面抗原P3 5基因重组表达质粒P3 5 /pGEX 2T ,并在大肠杆菌JM10 9中进行表达、纯化及鉴定。 方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P3 5抗原的基因片段 ,克隆入表达载体pGEX 2T ,并在大肠杆菌JM10 9中融合表达 ,经GSTrapTM亲和层析柱纯化出P3 5重组融合蛋白 ,以SDS PAGE电泳鉴定纯度、Western blot鉴定抗原性。 结果 成功构建了重组表达质粒P3 5 /pGEX 2T ,融合表达产物的分子质量约为 70kDa ;该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶 (GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。 结论 弓形虫表面抗原P3 5在大肠杆菌中有效表达 。

CDK5、p35/p25在血管性认知损害患者血液中的表达

目的探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶5(CDK5)、p35及p25在血管性认知损害(VCI)患者血液中的表达及可能作用。方法收集VCI病例91例,其中非痴呆性血管性认知损害(VCIND)49例,血管性痴呆(VAD)42例;同时收集脑卒中认知功能正常(NC)及健康人(N)各30例;应用RT-qPCR检测血液中CDK5mRNA的相对表达,Western blot法检测各组血液中CDK5、p35及p25的蛋白表达。结果各组CDK5mRNA相对表达及CDK5、p35、p25蛋白表达从高到低分别为VAD组>VCIND组>NC组>N组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 CDK5、p35及p25可能参与了VCI的发生,血管性认知功能损害程度与其表达水平呈正相关关系。

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。

三叉神经痛大鼠模型中Cdk5/p35的表达与活性

目的:探讨Cdk5激活剂p35在三叉神经痛过程中所起的作用。方法:以三叉神经眶下支(ION)的慢性压迫性损伤(CCI)建立的三叉神经痛大鼠模型为研究对象,采用Western印迹、免疫沉降和Cdk5活性分析方法,检测大鼠眶下神经慢性压迫性损伤(CCI-ION)后三叉神经脊束尾核(Vc)组织中Cdk5的活性变化和Cdk5、p35的表达水平。应用SPSS13.0软件包中的两两比较和扩展t检验进行统计学分析。结果:CCI-ION呈时间依赖形式诱导神经损伤侧Vc组织中的p35上调(第1天为1.23±0.15,第3天为1.36±0.12,第7天为1.62±0.17,第14天为1.83±0.16);Cdk5表达在CCI-ION第1天到第14天基本一致,而Cdk5的活性与p35表达具有一致性;CCI-ION第14天,Vc内的Cdk5活性(115.5Kcpm)是CCI-ION第1天Vc内的Cdk5活性(19.0Kcpm)的6倍,各组之间均有显著差异(P<0.01)。结论:Cdk5/p35与三叉神经痛过程中神经元突触变化及神经元可塑性有密切关系。