美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

对美国白蛾核型多角体病毒 (HycuNPV ,Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)p35基因的序列分析表明 :HycuNPVp35编码序列 90 0bp ,编码 2 99氨基酸。同源性分析表明 :HycuNPVp35与BomoNPVT3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为 99 9%、 95 7%、 93 6 %、 80 2 %和 87 2 % ,在氨基酸水平上为 99 7%、 90 3%、 77%、 6 4 9%和 73 2 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPVT3中位的H1 2 2 ,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPVp35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPVT3p35蛋白的相似。

棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的表达

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ Ａｃ Ｎ Ｐ Ｖ） 凋亡抑制基因ｐ３５ 的合成引物，从棉铃虫核型多角体病毒（ Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ） 基因组中用 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增到了１ｋｂ 片段。采用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 双脱氧核苷酸链终止银染法，测定了所扩增到的１ ０１０ｂｐ 全序列，发现其开放阅读框完整，长８９７ｂｐ ，编码２９９ 个氨基酸。用 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ 和 Ｐ Ｒ Ｏ Ｓ Ｉ Ｓ 软件分析发现，此片段与 Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ ｐ３５ 基因同源区核苷酸同源性为９１ ％ ，氨基酸同源性也达８１ ％ ，证明了所扩增的片段是 Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ 的ｐ３５ 基因。为了研究此ｐ３５ 基因的功能及其效应机制，克隆了这一基因并在大肠杆菌细胞中实现了表达。

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。

杆状病毒AcMNPV p35基因的克隆表达及多抗制备

用PCR方法扩增得到苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californic anucleopolyhedrovirus,AcM N-PV)p35基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)上,构建得到重组质粒pET-p35,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了1条约为55 ku的蛋白带。以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化融合蛋白,以纯化的融合蛋白制备多克隆抗体,效价为1/1 024。免疫印迹分析表明,该抗血清能与感染苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。

家蚕核型多角体病毒山东株p35基因的克隆及序列分析

根据家蚕核型多角体病毒T3株p35基因非编码区序列设计一对特异性引物,应用PCR技术从家蚕核型多角体病毒山东株中扩增得到一条1080bp的片段。测序结果表明,该片段含有p35基因,开放阅读框长900bp,编码299个氨基酸,分子量为34.91kDa,pI=6.4。序列分析表明,BmNPV山东株的p35基因与T3株存在差异。

江西部分地区猪痘病毒PCR检测及P35基因的分析

为了解江西部分地区猪痘病毒(SWPV)的感染及流行情况,从江西省7个地区(市)共36个规模化猪场采集55份疑似猪痘病猪的皮肤痘痂组织,应用PCR方法对其进行猪痘病毒核酸检测,并随机挑选19个PCR产物进行序列测定和P35基因序列分析。结果表明,55份样品中,有44份样品检测为SWPV阳性,阳性率高达80%;所测的19条序列与SWPV参考毒株(登录号:AF410153.1)P35基因核苷酸同源性为96.3%～98.4%,推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%;各序列之间的核苷酸同源性为97.7%～100%,推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%。结果表明江西省部分地区的猪群中存在猪痘病毒感染。

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95 .1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4% ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N1 4 6、S2 0 2 、E2 0 4、K2 44,在Bm NPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．

p35基因对MnCl_2诱导PC12细胞凋亡的作用

目的:探讨p35基因对氯化锰(MnCl2)诱导的PC12细胞凋亡的作用。方法:将p35基因转染PC12细胞得到可稳定表达p35基因的PC12/p35细胞株,使用相差显微镜观察、MTT染色和流式细胞分析等方法检测p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞凋亡的作用。结果:p35基因在PC12细胞中的稳定表达可以有效地抑制MnCl2诱导的PC12细胞凋亡。结论:p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞具有保护作用。

杆状病毒p35基因序列与分子进化

本文对家蚕核多角体病毒(BomoNPV)、苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AucaNPV)、斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpliNPV)、粘虫核型多角体病毒(LeseNPV)、美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)和薄荷灰夜蛾核型多角体病毒(RaouNPV)6类杆状病毒的p35基因进行序列比对和进化分析。结果显示,LeseNPV、AucaNPV、SpliNPV、RaouNPV、BomoNPVp35基因核苷酸序列之间同源性在78%￣100%之间,氨基酸间的同源性在58%￣100%之间,总体上p35基因在进化上具有保守性;Chou-Fasman法对蛋白2级结构的预测结果显示,不同杆状病毒P35蛋白的2级结构在总体上具相似性,但在某些区域显示明显的差异,这种差异也许是导致P35抗凋亡活性不同的原因。Neighbor-Joining算法建立了基于p35基因的分子进化系统树,结果显示:LeseNPV处于无根树的最根部,与其它NPV相距较远,AucaNPV、SpliNPV、RaoumuNPV各自形成独立的分枝,BomoNPV与HycuNPV形成独立的1组;12种不同来源的BomoNPVp35基因的系统进化分析显示,BomoNPV基本上按采集地聚类。

油桐尺蠖核型多角体病毒p35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术从油桐尺蠖核型多角体病毒基因组中扩增得到p35基因的DNA序列,把PCR产物克隆到pMD 18载体上,核苷酸序列测定表明此片段与AcNPVp35基因同源性为100%,继而构建了表达质粒pGBp35,诱导后经SDS PAGE检测表明获得了BsNPVp35基因在大肠杆菌BL21中包涵体形式的特异表达。

粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因的克隆与序列分析

粉纹夜蛾核型多角体病毒ｐ３５基因的克隆与序列分析施宪宗１王王旬章龙綮新２代小江曲士芮陈曲侯１庞义（中山大学生物防治国家重点实验室，广州５１０２７５）关键词ＴｎＮＰＶｐ３５基因，序列分析，细胞凋亡目前所知，杆状病毒编码两种阻遏宿主细胞因病毒感染而诱发细...

猪痘病毒P35基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪痘病毒(SWPV)血清学检测方法,根据SWPV的P35基因设计1对引物,从SWPV江西分离株(JX01)的细胞培养物中扩增到975bp的P35基因。将P35基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,将其进行原核表达,经SDS-PAGE分析,表达P35重组蛋白约64 000。采用MagneGST蛋白纯化试剂盒纯化P35重组蛋白,以纯化的重组蛋白为检测抗原,建立了SWPV抗体间接ELISA检测方法,间接ELISA条件为:P35重组蛋白包被质量浓度为10mg/L,被检猪血清的稀释倍数为1∶80。以建立的间接ELISA方法对江西省47个猪场的471份猪血清进行了SWPV抗体的检测,结果猪血清抗体阳性率为35.7%,表明江西省部分猪场存在较普遍的SWPV感染。

凋亡抑制基因p35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus,Ac NPV)和多角体基因缺失 (ocu- )的 Ac NPV分别感染 Sf9- 35细胞 ,研究了 p35的稳定表达对杆状病毒增殖的影响 .发现p35基因在 Sf9- 35细胞内组成型表达能够影响野生型 Ac NPV包涵体的形成 ,大幅度提高出芽病毒 (BuddedVirus,BV;即无包涵体病毒粒子 )产量 .

含人IL-12基因的重组质粒p2Bac-hIL-12p35p40的构建

用PCR技术克隆hIL－12p35和p40两个亚基的cDNA,经酶切反应和琼脂电泳，获得的p35和p40基因的大小分别为0.77kb和1.1kb。SK+质粒酶切后和p35、p40片段分别进行连接．形成SK+－p35和SK+－p40重组质粒。再经酶切反应．p35、p40片段先后连接至p2Bac质粒中，形成同时含有hIL－12两个亚基基因的重组质粒p2Bac－hIL－12p35p40。SK+－p35和SK+－p40作为模板，进行p35、p40重组基因的测序，其结果与文献报道一致。

小鼠神经细胞cdc2类蛋白激酶调节亚基p35^(Nck5a)基因的克隆和鉴定

目的： 获取小鼠神经细胞ｃｄｃ２ 类激酶（Ｎｃｌｋ）调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ，用于构建基因重复性打靶载体。方法： 用噬斑原位杂交法从λＰＳ基因文库中克隆小鼠ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因；用限制性内切酶酶切图谱分析和序列测定进行基因组结构分析。结果： 获得较完整的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ酶切图谱；该基因由一个外显子组成，长９２４ ｂｐ，编码３０７ 个氨基酸的蛋白质，内含子长２０８ ｂｐ，位于５′端侧翼序列中。测定的序列（－ １ ０８０ 至＋ ９２４ ｂｐ 和＋ ３ ７２１至＋ ４ ２２２ ｂｐ）与已报道的序列基本一致，仅在－ １３５和－ ２９５位各插入一个碱基Ｇ。结论： 得到的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ 片段长约１１ ｋｂ， 其５′端侧翼序列含有一些已知的调控序列，３′端含有ｐｏｌｙ Ａ 的信号序列。

p35^(Nck5a)基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复，采用常规的分子克隆技术，构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆，细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定，２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复，同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。

小鼠神经细胞p35^(nck5a)基因5′非编码区基因表达调控功能初步研究

目的 :观察阿尔茨海默病 (AD)的相关基因 p35 nck5a基因 5′侧翼区指导报告基因表达的能力。方法 :将对本实验室所克隆的 p35 nck5a基因 5′侧翼片段连接于报告基因 β-半乳糖苷酶基因的上游构建表达载体 ,利用体外培养细胞和转基因小鼠实验体系来观察该片段在体内、外基因表达调控的差异。结果 :体外培养细胞中 p35 nck5a基因 5′侧翼序列不具有决定报告基因神经特异性表达的能力 ,但在基因组中整合有相同表达载体的转基因小鼠体内却能够指导报告基因的神经限制性表达。 结论 :这种差异提示进行体内。

杆状病毒的gp64和p35基因的联合应用

该发明专利是一种杆状病毒的gp64和p35基因的联合应用。杆状病毒AcMNPV即苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒的gp64和p35基因联合在应用中共同得到表达，AcMNPV的gp64基因和p35基因在GenBank中的索引号是NC001623。该专利还包括AcMNPV的gp64和p35基因联合在转移载体中的用途。

穿透支原体主要外膜蛋白pET20b(+)/p35重组载体的构建、表达及鉴定

目的 构建高表达且稳定的pET2 0b(+ ) /p3 5重载体,能在其中进行诱导高表达并得到纯化的p3 5蛋白。 方法 运用Blast、Pfam等生物信息学手段对穿透支原体(Mpe) p3 5基因序列结构与功能预测,将p3 5基因全长插入原核表达载体pET2 0b(+ )中,在BL2 1StarTM(DE3 )进行诱导表达、用Ni柱纯化,在GSH -GSSH体系中逐渐降低其变性剂的方法复性蛋白,Western -blot进行鉴定。 结果 成功的构建了pET2 0b(+ ) /p3 5重组载体,并能在宿主菌中较高表达;此蛋白以包涵体的形式进行表达。 结论 得到了纯化的p3 5蛋白。