益肾通癃汤通过上调miR-145-5p抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路抗前列腺癌作用机制研究

目的探讨益肾通癃汤(YSTLD)通过上调miR-145-5p抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路抗前列腺癌的作用机制。方法借助miRNA芯片技术检测YSTLD处理前列腺癌PC-3细胞后的miRNA表达谱的变化,筛选miRNA芯片结果中差异显著的miRNA,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)进行验证。慢病毒转染miR-145-5p入前列腺癌PC-3细胞,CCK8法及划痕实验检测miR-145-5p对前列腺癌PC-3细胞增殖与迁移作用;qRT-PCR法及Wstern blot法检测miR-145-5p对TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路及凋亡相关基因caspase3、TNF-α、Bax、Bcl-2表达的影响;qRT-PCR及Wstern blot法检测YSTLD含药血清对miR-145-5p、TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路及凋亡相关基因caspase3、TNF-α、Bax、Bcl-2表达的影响。结果miRNA基因芯片检测发现YSTLD处理前列腺癌PC-3细胞后存在35种miRNA表达水平与对照组存在显著差异,其中以miR-145-5p差异最为显著,同时qRT-PCR验证发现YSTLD处理的PC-3细胞中的miR-145-5p水平显著高于DMSO对照组(P<0.05)。慢病毒转染miR-145-5p入前列腺癌PC-3细胞后,发现miR-145-5p能抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移。过表达miR-145-5p可上调前列腺癌PC-3细胞caspase3、TNF-α及Bax mRNA表达水平,下调p38 MAPK、p65 NF-κB及Bcl-2的mRNA表达水平(P<0.05),同时上调前列腺癌PC-3细胞caspase3蛋白表达水平,下调TLR4、p38 MAPK、p65 NF-κB的蛋白表达水平(P<0.05);YSTLD含药血清在干预前列腺癌PC-3细胞后,可上调前列腺癌PC-3细胞caspase3、TNF-α及Bax mRNA表达水平,下调p38 MAPK、p65 NF-κB、Bcl-2、TRAF1的mRNA表达水平(P<0.05),同时上调前列腺癌PC-3细胞caspase3蛋白表达水平,下调TLR4、p38 MARK、p65 NF-κB、TRAF1的蛋白表达水平(P<0.05)。结论YSTLD可通过上调miR-145-5p的表达水平,抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路促进前列腺癌PC-3细胞凋亡,这可能是YSTLD抗前列腺癌的重要机制。

二噁英对HepG2和SPC-A1细胞P53和P38 MAPK基因表达的影响

[目的 ]探讨二英 (TCDD)对人体肝癌细胞株 (HepG2 )和肺腺癌细胞株 (SPC A1)中P5 3基因和P3 8MAPK基因表达的影响 ,并研究剂量与效应的关系。 [方法 ]用常规的细胞培养方法 ,利用RT PCR方法对 2种基因进行表达 ,并以 β actin作为内对照。对基因表达的强度进行比较分析。[结果 ]P3 8MAPK基因在 2种细胞中都有表达 ,在HepG2中 ,P3 8MAPK基因表达随浓度 1、5、10、2 0nmol/L增加先抑后扬 (表达值分别为 0 .90 0、0 .82 0、1.2 60、0 .898,P <0 0 5 ) ,而在SPC A1中差异无显著性 (表达值分别为 0 .898、 0 .919、 0 .80 8、 0 .846,P >0 0 5 )。P5 3基因在人体肝癌细胞株(HepG2 )中有表达 ,并随浓度增加而上调 (表达值分别为 0 .764、0 .890、1.0 99、1.2 18、1.40 5 ,P <0 .0 5 )而在肺腺癌细胞株(SPC A1)中未见表达。 [结论 ]二英对人体肝癌细胞株 (HepG2 )中P5 3基因和P3 8MAPK基因有诱导作用 ,在肺腺癌细胞株 (SPC A1)中仅见对P3 8MAPK基因有诱导作用 ,P5

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因-p38MAPK基因

目的 克隆 1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。 方法 应用改良的mRNA差异显示技术 ,对 1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析 ,并对其中 1个从 2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。 结果 所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38MAPK(p38betamitogen activatedpro teinkinase ,p38MAPK β)基因的同源性分别为 91%和 85 %。Northerndotblot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织中表达最高。

小菜蛾p38 MAPK基因的克隆与生物信息学分析

小菜蛾（PhttellaxylostellaL．）是一种危害十字花科植物的世界性害虫，研究其基因功能为寻找新的小菜蛾防治方法具有重要意义。本研究克隆了小菜蛾p38MAPK基因的开放阅读框（ORF），并根据其DNA序列推导出了蛋白一级结构，发现该基因编码一个含有349个氨基酸残基的蛋白。通过SMART网站分析发现该蛋白在第20～304位氨基酸残基区域存在着一个典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域，说明它是一个潜在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。Blast比对发现Pxp38基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHOGl基因、人类Homosapiensp38基因在蛋白～级结构上的相似性分别是91．7％、51．6％和78．6％，说明p3sMAPK基因在进化上具有较高的保守性。·

腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞p38MAPK及bcl-2表达的影响

目的:探讨腺病毒介导的IL-24基因(Ad5F35-hIL-24)对人胶质瘤细胞(U251细胞)的杀伤作用,以及对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和bcl-2蛋白表达的影响.方法:应用MTT方法和双荧光染色方法测定Ad5F35-hIL-24对U251细胞的抑制作用;蛋白质印迹法检测p38MAPK,p-p38MAPK和bcl-2的表达变化.结果:MTT和双荧光染色方法检测表明,与空载体Ad5F35-VEC组及空白对照组相比,Ad5F35-hIL-24对U251细胞有明显抑制作用.蛋白质印迹检测显示,Ad5F35-hIL-24组的p-p38MAPK蛋白表达水平增加,bcl-2蛋白表达减少.结论:腺病毒介导的IL-24基因对胶质瘤U251细胞杀伤作用明显,提示p38MAPK信号转导通路及bcl-2基因表达是Ad5F35-hIL-24重要作用靶点,该结果对于临床治疗胶质瘤有一定参考意义.

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5'非编码区长122 bp,3'非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38。氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 k Da,理论等电点为5.68。同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98%。通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED。系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支。荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用。

龙胆泻肝汤治疗带状疱疹的效果及对p38 MAPK基因表达的影响

目的分析龙胆泻肝汤治疗带状疱疹的临床疗效及对患处皮肤p38 MAPK基因表达的影响。方法选取2016年1月~2017年6月广州市红十字会医院皮肤科收治的带状疱疹患者153例,采用随机信封法分为观察组(80例)和对照组(73例)。对照组采用基础治疗联合红蓝光治疗,观察组在对照组基础上联合龙胆泻肝汤治疗。记录两组患者术后水疱消退时间、结痂时间及疼痛缓解时间,并评估临床疗效;检测治疗前及治疗结束后4周患者皮肤中p38 MAPK基因表达水平。结果治疗后,观察组患者水疱消退时间、结痂时间及疼痛缓解时间均显著短于对照组(P<0.05);治疗后,观察组患者治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05);治疗后,两组患者患处皮肤p38 MAPK基因相对表达量均显著降低(P<0.05),且观察组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论龙胆泻肝汤联合红蓝光治疗带状疱疹可有效提高临床疗效,改善病灶区p38 MAPK基因水平。

马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38)cDNA全长序列并对其序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PmMAPK p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmMAPK p38 cDNA全长为1516 bp,开放阅读框长度为1071 bp,共编码356个氨基酸,理论分子量为40.88 ku;结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域;多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高;荧光定量分析结果表明,该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为外套膜,最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的5倍;而在哈维氏弧菌刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在2 h达到最高,8 h降到最低,最高约为最低的4倍。研究表明,PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应,尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。

MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:为了研究MAPK激活蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2,MK2)细胞内定位与其功能的关系,构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(WT)通过定点突变技术构建其无活性突变体MK2(320A)和活性突变体MK2(320E),转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况。结果:各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,MK2(WT)主要分布于细胞核内,MK2(320E)主要分布于细胞质内,而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到紫外线(UV)刺激后,MK2(WT)和MK2(320A)移位出核,而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变。结论:成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达,观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响。

p38 MAPK基因在西方蜜蜂越冬期表达模式的研究

【目的】p38 MAPK基因在昆虫的低温响应机制中发挥着重要作用,本研究旨在探究p38 MAPK基因在西方蜜蜂Apismellifera越冬期内表达规律。【方法】本研究对西方蜜蜂p38 MAPK蛋白序列进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术检测该基因在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica、欧洲黑蜂Apis mellifera mellifera、高加索蜂Apis mellifera caucasica和卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica于不同越冬时期和不同越冬方式下体内的表达量。【结果】西方蜜蜂p38 MAPK包含1083 bp的开放阅读框区域,编码360个氨基酸,包含TGY双磷酸化三肽模体序列和磷酸化激活环序列。p38 MAPK在蜜蜂所有组织中均有表达,分别在胸部和腹部处于最高和最低表达丰度。p38 MAPK mRNA在不同蜂种不同越冬时期的表达量存在显著差异,4个蜂种于室外越冬时p38 MAPK的表达量均显著高于室内越冬(P<0.05);随着蜜蜂越冬持续时间的延长,意大利蜜蜂和欧洲黑蜂不同越冬方式下体内p38 MAPK的表达均呈现先上升后下降的表达趋势,高加索蜂在室外与室内越冬时体内该基因的表达量均表现出持续上升的表达趋势,该基因在卡尼鄂拉蜂中的表达趋势与其他3个蜂种呈现一定差异,卡尼鄂拉蜂p38 MAPK在室内越冬方式下表达量保持恒定,但在室外越冬方式下表现出先下降后上升的表达趋势;比较室外越冬情况下4个蜂种于不同越冬时期体内p38 MAPK表达量后发现,除在次年的1月外,其他越冬时期4个蜂种体内p38 MAPK的表达量均存在显著差异(P<0.05)。【结论】p38 MAPK基因在西方蜜蜂越冬期内发挥着重要的生理功能,p38 MAPK信号通路可作为蜜蜂抗寒机制研究的候选信号通路。

下调NDRG4表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的 观察下调N-myc下游调节基因4(NDRG4)表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法 将卵巢癌SKOV3细胞、HO8910细胞各分为转染组和对照组,转染组细胞转染siRNA-NDRG4,对照组细胞转染无意义空白siRNA。分别于转染后0、24、48、72h,采用MTT法检测细胞增殖能力;转染48h,采用流式细胞术测算细胞凋亡率,采用Western blotting法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)及P38/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白(p-P38/MAPK、P38/MAPK)。结果 转染组SKOV3、HO8910细胞转染后48、72h增殖能力均高于相应对照组,转染48h细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均低于相应对照组(P均<0.05)。转染组SKOV3、HO8910细胞中Bcl-2蛋白相对表达量较对照组增高,Bax蛋白、p-P38/MAPK相对表达量较对照组降低(P均<0.05)。结论 NDRG4表达下调后卵巢癌细胞增殖能力增高、凋亡减少,其机制可能与调节Bcl-2/Bax表达及P38/MAPK信号通路活性有关。

牛乳腺炎粪肠球菌逃逸巨噬细胞的分子机制研究

为研究牛乳腺炎粪肠球菌β溶血素cylA基因对牛单核巨噬细胞(BMC-7)吞噬功能和免疫调节的分子机制,利用牛乳腺炎粪肠球菌临床分离的野生型菌株(BME1708)及cylA基因缺失突变株(BME1708△cylA)对牛巨噬细胞进行侵染,利用MTT检测法检测细胞活性;在明确细胞活性不受影响的条件下,提取被侵染的BMC-7总mRNA,利用RT-qPCR检测细胞因子IL-4、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α以及NOS2的转录水平差异,采用ELISA法检测相应表达水平;利用Western blot检测牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对BMC-7的p38 MAPK信号通路磷酸化水平的影响;利用p38 MAPK信号通路抑制剂(PD 169316)孵育BMC-7,ELISA法检测相应细胞因子表达水平,以明确cylA基因调控该信号通路的分子机制。结果显示:与BME1708组相比,BME1708△cylA组在IL-10和TNF-α转录水平下调,IL-4、IL-8、IL-12以及NOS2转录水平上调,差异均具有统计学意义(P<0.05);与BME1708组相比,BME1708△cylA组IL-10表达水平下调,IL-4、IL-8、IL-12表达水平上调,差异均具有统计学意义(P<0.05);TNF-α的表达水平降低,但是差异不显著;对p38 MAPK磷酸化检测结果显示,粪肠球菌cylA基因可以激活p38 MAPK信号通路并使其磷酸化;在PD 169316孵育后,与未添加抑制剂组相比,添加抑制剂组的IL-10、TNF-α的表达水平下调,IL-4、IL-8、IL-12的表达水平上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,p38 MAPK信号通路为粪肠球菌β溶血素cylA基因发挥免疫调节机制的重要通路,该结论为奶牛乳腺炎的治疗及防控提供新的靶位,可通过其毒力的钝化以及对p38 MAPK信号通路进行识别及信号通路封闭,对粪肠球菌感染进行有效防控。