壮药龙盘止咳方通过调控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路减轻急性支气管炎小鼠肺损伤

目的:探究壮药龙盘止咳方减轻急性支气管炎小鼠肺损伤的潜在机制。方法:KM小鼠采用烟熏法建立急性支气管炎模型,将造模成功的60只小鼠随机分为模型组、SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂,5 mg/kg)组、高剂量(10.4 g/kg)龙盘止咳方组、低剂量(5.2 g/kg)龙盘止咳方组和龙盘止咳方(10.4 g/kg)+SB203580(5 mg/kg)组,每组12只,另将正常饲养的12只小鼠设为对照组。分组完成后进行药物干预,每天1次,连续1周。观察给药前后各组小鼠的一般状态变化;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测BALF中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平;HE染色观察肺组织病理学变化;免疫组化法检测肺组织核因子κB(NF-κB)p65的阳性表达;RT-qPCR检测肺组织核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平;Western blot检测肺组织p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB/NLRP3通路相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,模型组小鼠出现咳嗽、流涕、呼吸急促等症状,且肺部支气管可见炎性细胞浸润、肺泡壁和支气管壁增厚、黏膜充血和水肿等病理损伤,肺组织NF-κB p65在胞核中呈强阳性表达,BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平,肺组织NLRP3、IL-1β、ASC和caspase-1的mRNA表达水平,以及p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3和cleaved caspase-1蛋白水平显著升高(P<0.05),胞质NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,高、低剂量龙盘止咳方组和SB203580组小鼠咳嗽、流涕、呼吸急促等症状,以及肺部支气管炎症细胞浸润等病理损伤明显减轻,肺组织胞核NF-κB p65呈阳性表达的细胞数减少,BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平,肺组织NLRP3、IL-1β、ASC和caspase-1的mRNA表达水平,以及p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3和cleaved caspase-1蛋白水平显著降低(P<0.05),胞质NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05)。且龙盘止咳方和SB203580联合应用对p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路及肺部炎症的抑制作用均优于单独应用。结论:壮药龙盘止咳方可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路的激活,减少肺部炎症细胞因子的产生,从而减轻急性支气管炎小鼠肺损伤。

短穗兔耳草中3个化合物对大鼠慢性酒精性肝损伤合并痛风性关节炎的作用及其机制研究

目的通过建立大鼠慢性酒精性肝损伤合并痛风性关节炎模型,研究槲皮素、松果菊苷和芹菜素对p38MAPK/JNK、TLR4/MyD88/NF-κB和NLRP3信号通路的影响,探讨短穗兔耳草中单体化合物抗慢性酒精性肝损伤合并痛风性关节炎的作用机制。方法将80只大鼠随机分为正常组,模型组,联苯双酯组(100 mg·kg^(-1)),秋水仙碱组(0.3 mg·kg^(-1))及槲皮素(50、25 mg·kg^(-1))、松果菊苷(50、25 mg·kg^(-1))、芹菜素(50、25 mg·kg^(-1))各剂量组。每日上午按10 mL·kg^(-1)给药,下午以4 mL·kg^(-1)开始梯度给56度红星二锅头,每周增加2 mL·kg^(-1),直至10 mL·kg^(-1)保持,连续灌胃8周。于灌胃第53天复制痛风性关节炎模型,检测各时间段足趾容积。第8周末次给药后取血,检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG);酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β);蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测肝脏和滑膜中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组各时间段大鼠足肿胀度均明显升高(P<0.05,P<0.01);血清中ALT、AST、ALP、TC、TG、IL-1β水平均明显升高(P<0.01);肝组织和滑膜组织中p-p38MAPK、p-JNK、MyD88、p-NF-κB、TLR4、NLRP3蛋白表达水平均有不同程度升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组在24 h足肿胀度呈现明显下降趋势(P<0.01);各给药组ALT、TC水平有不同程度下降(P<0.05,P<0.01);除松果菊苷低剂量组外,各给药组AST、ALP水平有不同程度下降(P<0.01);除槲皮素高剂量组外,各给药组TG水平有不同程度下降(P<0.01);各组大鼠肝脏组织及滑膜组织中p-p38MAPK、p-JNK、MyD88、p-NF-κB、TLR4、NLRP3蛋白表达量均下调(P<0.05,P<0.01)。结论短穗兔耳草中单体对慢性酒精性肝损伤合并痛风性关节炎大鼠模型表现出一定的异病同治的治疗效果,其可能是基于p38MAPK/JNK、TLR4/MyD88/NF-κB和NLRP3信号通路发挥治疗作用的。

CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达

背景:核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性因子被证实与多种炎症性疾病相关,调控其表达将成为治疗相关疾病的关键。目的:验证CD1d参与了调控NLRP3炎性因子表达,并且进一步证明CD1d是通过信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α,SIRPα)来达到调控目的。方法:①使用Flag-CD1d、HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染293T细胞进行免疫共沉淀实验,验证CD1d与SIRPα的相互作用;②使用Flag-CD1d慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞,RT-qPCR检测NLRP3等基因表达;③使用HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞,在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达;④使用SIRPα慢病毒RNAi载体转染RAW264.7细胞,在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达。结果与结论:①免疫共沉淀实验证实CD1d与SIRPα存在相互作用;②过表达CD1d基因后,NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显低于正常组(P<0.05);③在脂多糖刺激后过表达SIRPα组NLRP3基因表达明显低于正常组(P<0.05);pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达与正常组差异无显著性意义(P>0.05);过表达SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显低于SIRPα干扰组(P<0.01);④脂多糖刺激后干扰SIRPα组NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显高于正常组(P<0.05);干扰SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显高于过表达SIRPα组(P<0.01);⑤结果表明,CD1d与细胞膜上SIRPα形成复合物,通过SIRPα抑制下游p38MAPK/NF-κB通路,最终达到抑制NLRP3等炎性因子表达的目的。