PLA2G4C通过p38/MAPK信号通路介导线粒体自噬促进DLBCL进展的实验研究

目的研究磷脂酶A2ⅣC组(phospholipase A2 groupⅣC,PLA2G4C)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用及其可能调节机制。方法通过免疫印迹法(Western blot)检测PLA2G4C在DLBCL组织和细胞中的表达。构建PLA2G4C过表达或敲低表达的DLBCL细胞系,后用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或p38抑制剂SB203580处理细胞24h。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PLA2G4C转染效率;Western blot检测PLA2G4C蛋白、线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,MAP1 LC3Ⅱ/Ⅰ),Beclin1,p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],p38/丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)通路相关蛋白[磷酸化p38/MAPK(phosphorylated-p38/MAPK,p-p38/MAPK)]表达水平;CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。进一步构建异种移植瘤裸鼠模型,观察PLA2G4C对裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬的影响。结果DLBCL患者淋巴瘤组织中PLA2G4C蛋白表达显著高于反应性增生淋巴结组织(3.47±0.42 vs 1.01±0.02),差异具有统计学意义(t=-37.002,P<0.001);DLBCL细胞中PLA2G4C蛋白水平显著高于人淋巴母细胞样细胞系和B细胞淋巴瘤细胞系,差异具有统计学意义(F=73.771,P<0.001)。沉默PLA2G4C显著降低DLBCL细胞活力和侵袭能力,诱导细胞凋亡(t=6.909~11.390);过表达PLA2G4C后结果与之相反(t=2.392~19.778),差异具有统计学意义(均P<0.001)。且过表达PLA2G4C显著促进线粒体自噬的发生,而CQ或SB203580处理则可显著逆转PLA2G4C过表达对DLBCL细胞生物学行为及线粒体自噬的作用。体内裸鼠实验显示,敲低PLA2G4C显著抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=13.816~25.926,均P<0.001)。结论PLA2G4C在DLBCL中表达显著上调,可能通过促进p38/MAPK信号通路介导的线粒体自噬,促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,参与DLBCL的发生发展。

抑制p38/p53信号通路对癫痫大鼠神经元损伤的保护作用

目的探讨p38/p53信号通路在癫痫持续状态大鼠海马神经元的活化规律,及对癫痫后神经元损伤的保护作用。方法 40只大鼠随机分为正常对照组、癫痫组、抑制剂组、二甲亚枫溶剂对照组,建立氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠模型,HE染色观察大鼠海马CA1区的神经元病理改变,免疫组化染色观察p38/p-p38、p53/p-p53阳性细胞的着色情况。结果癫痫组海马CA1区可见到神经元变性、坏死,抑制剂组较轻。癫痫组各时间点p38/p-p38阳性细胞数较对照组增加,2 h达高峰,6 h后减少,抑制剂组阳性细胞数较癫痫组减少。癫痫组各时间点p53/p-p53免疫阳性细胞数较对照组增多,癫痫发作时间越长,阳性细胞数越多,抑制剂组阳性细胞数较癫痫组减少。结论 p38抑制剂对SE大鼠神经元损伤有一定保护作用,其机制与阻断p53介导的细胞凋亡通路有关。

复方排石汤剂对草酸钙肾结石模型大鼠保护作用实验研究

目的:观察复方排石汤对草酸钙肾结石模型大鼠的药效,并初步探索其可能机制。方法:将42只雄性SD大鼠随机分为6组,即正常对照组、模型对照组、阳性对照组、复方排石汤剂低(0.26g·mL-1)、中(0.52g·mL-1)、高(1.03g·mL-1)剂量组。采用乙二醇和氯化铵试剂联合诱导SD大鼠草酸钙肾结石实验模型,造模同时正常对照组及模型对照组给予饮用水灌胃,阳性对照组给予25%枸橼酸钾溶液灌胃,复方排石汤高、中、低剂量组分别给予复方排石汤剂低、中、高剂量灌胃,干预28 d。试验期间通过观测大鼠体质量等一般体征,检测大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、血钙(Ca2+)以及尿液中尿素氮、肌酐含量及肾组织病理变化程度;评价肾组织中p38 MAPK信号通路的激活[p38磷酸化程度(p-p38/p38)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、P47-phox水平]情况。结果:4周后,模型对照组大鼠血清SCr和BUN水平较正常对照组升高(P<0.05)。与模型对照组比较,阳性对照组大鼠给予枸橼酸钾治疗后血清SCr、BUN水平降低(P<0.05);复方排石汤剂中剂量组和复方排石汤剂高剂量组大鼠血清SCr、BUN水平降低(P<0.05),复方排石汤剂低剂量组大鼠血清SCr、BUN水平有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。4周后,模型对照组大鼠尿Ca2+和尿草酸含量较正常对照组升高(P<0.05),血Ca2+浓度未见显著改变(P>0.05)。与模型对照组比较,阳性对照组大鼠尿Ca2+和尿草酸含量降低(P<0.05);复方排石汤剂中剂量组和复方排石汤剂高剂量组大鼠尿Ca2+和尿草酸含量降低(P<0.05),复方排石汤剂低剂量组大鼠尿草酸含量降低(P<0.05)。4周后,模型对照组大鼠外周血NEUT比例较正常对照组升高(P<0.05),LYMPH比例较正常对照组降低(P<0.05)。与模型对照组比较,阳性对照组大鼠NEUT比例降低(P<0.05),LYMPH比例升高(P<0.05);复方排石汤剂中剂量组和复方排石汤剂高剂量组大鼠NEUT比例降低(P<0.05),LYMPH比例升高(P<0.05)。模型对照组大鼠肾脏组织p-p38/p38、TGF-β1、P47-phox水平较正常对照组升高(P<0.05)。与模型对照组比较,阳性对照组和复方排石汤剂高剂量组大鼠肾脏p-p38/p38、TGF-β1、P47-phox水平均降低(P<0.05),复方排石汤剂中剂量组仅P47-phox水平降低(P<0.05),复方排石汤剂低剂量仅TGF-β1水平降低(P<0.05)。显微镜下观察:模型对照组大鼠肾组织中草酸钙结晶的形成明显,阳性对照组、复方排石汤剂各剂量组草酸钙结晶形成较少。结论:复方排石汤剂对草酸钙肾结石模型大鼠具有良好的保护作用,其机制可能与抑制MAPK通路p38磷酸化有关。

米诺环素对大鼠脑缺血-再灌注损伤后血脑屏障的保护机制

目的观察米诺环素对大鼠脑缺血-再灌注损伤(IRI)后基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达及血脑屏障通透性的影响,并探讨其与p38信号通路的关系。方法采用线栓法阻塞大脑中动脉制备大鼠局灶性脑IRI模型,将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组及米诺环素组(n=10)。IRI 24 h后,采用伊文思蓝(EB)法测定缺血脑组织血脑屏障通透性的改变,Western blotting法检测MMP-9、claudin-5蛋白表达的变化及p38的磷酸化水平。结果与假手术组比较,模型对照组血脑屏障通透性在IRI 24 h后明显增加[(4.55±0.69)μg·g-1比(0.55±0.08)μg·g-1],MMP-9蛋白表达显著升高(1.18±0.12比0.15±0.02),p38磷酸化水平上升(0.67±0.07比0.11±0.02),claudin-5蛋白表达降低(P<0.05);与模型对照组比较,米诺环素组血脑屏障通透性[(2.82±0.46)μg·g-1比(4.55±0.69)μg·g-1],MMP-9蛋白(0.77±0.06比1.18±0.12)及p38磷酸化水平(0.36±0.04比0.67±0.07)均明显降低,claudin-5蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论大鼠局灶性脑IRI后,米诺环素通过调节MMP-9及claudin-5蛋白的表达而减轻血脑屏障破坏,其保护作用可能与抑制p38信号通路有关。

IGF1通过BMP2-Smad1/5信号通路调控犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化

目的探讨骨形态形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)-Smad1/5及p38MAPK信号通路在胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)介导的促犬上颌窦黏膜干细胞(maxillary sinus membrane stem cells,MSMSCs)成骨分化中的作用。方法构建表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1,IGF1)基因的重组腺病毒载体(recombinant adenovirus,rAdv)Ad-IGF1。感染Ad-IGF1的犬上颌窦黏膜干细胞,经成骨诱导培养后,qRT-PCR和Western blot检测BMP-Smads信号通路中重要信号蛋白Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达;免疫组化观察磷酸化Smad1/5核转位情况;qRT-PCR及Western blot检测BMP-Smads通路抑制剂Noggin和p38MAPK信号通路抑制剂SB203580对IGF1介导的促犬MSMSCs成骨分化的影响。结果成功构建IGF1基因表达重组腺病毒载体Ad-IGF1;感染Ad-IGF1的犬MSMSCs,经成骨诱导培养后,Smad1/5的磷酸化水平和BMP2蛋白的表达升高,IGF1可促使Smad1/5核转位;BMP-Smads信号通路抑制剂Noggin可抑制Smad1/5的磷酸化,降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达,钙结节形成减少。p38MAPK信号通路抑制剂SB203580不能降低Ad-IGF1犬MSMSCs的p38磷酸化水平,亦不能降低成骨标志物Runx2、OPN和ALP mRNA的表达。结论犬MSMSCs成骨分化过程中,IGF1通过经典的Smads蛋白依赖性信号转导通路BMP2-Smad1/5促进成骨,而Smads蛋白非依赖性信号转导通路p38MAPK在IGF1介导的犬MSMSCs成骨过程中可能并不发挥作用。

天然冰片开放血-脑屏障及潜在抑制肿瘤作用机制的研究进展

随着工业水平的发展,现代化交通工具的广泛应用以及环境问题,颅脑外伤和脑肿瘤的发生率正在逐步上升,这些颅脑疾病因其致残、病死率较高而被称为急危重病。对该类疾病的治疗药物研究一直是医药行业的棘手问题。由于许多药物不能够通过血-脑屏障或因通过量较少,因此达不到治疗疾病的作用。冰片是一种芳香开窍类中药,中医称之为“引佐药”,具有较强的脂溶性,易透过并开放血-脑屏障,可增加其他药物的透过率以达到更好的疗效。另外,冰片可通过改变体内神经递质的含量以调节血管,且具有一定的脑保护及潜在抑制肿瘤生长的作用,对颅内病变的药物治疗有着重要的理论意义及应用价值。

金樱子滴眼液对糖尿病性白内障大鼠晶状体氧化应激及p38 MAPK信号通路的调节作用

目的 探讨金樱子滴眼液对糖尿病性白内障大鼠晶状体氧化应激及p38 MAPK信号通路的调节作用。方法 将35只SD雄性大鼠随机分为对照组、糖尿病性白内障模型组以及金樱子滴眼液低剂量干预组、金樱子滴眼液中剂量干预组、金樱子滴眼液高剂量干预组,每组7只。经腹腔注射65 mg/kg链脲佐菌素(STZ)溶液建立糖尿病性白内障模型,金樱子滴眼液干预组分别以浓度为0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.1 mg/ml的金樱子滴眼液滴眼,4次/d,连续干预12周。每周检测大鼠体重,第6、12周利用裂隙灯观察晶状体混浊程度。干预结束后,收集大鼠两侧眼球晶状体,检测晶状体组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;采用蛋白质免疫印迹法检测晶状体组织中凋亡蛋白Bcl-2、Bax,以及p38 MAPK信号通路蛋白p38 MAPK、p-p38 MAPK、MKK6及p-MKK6表达水平。结果 给药前各组大鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05);给药干预期间,模型组大鼠体重明显低于对照组(P<0.05),干预组大鼠体重高于模型组(P<0.05)。模型组晶状体混浊程度高于对照组(P<0.05),干预组大鼠治疗后晶状体混浊程度低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠晶状体中MDA水平高于对照组(P<0.05),SOD和GSH-Px水平低于对照组(P<0.05);治疗后干预组MDA水平低于模型组,SOD和GSH-Px水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠晶状体中凋亡蛋白Bcl-2表达水平低于对照组(P<0.05),Bax蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),Bcl-2/Bax值小于对照组(P<0.05);治疗后干预组晶状体中凋亡蛋白Bcl-2表达水平高于模型组(P<0.05),Bax蛋白表达水平低于模型组(P<0.05),Bcl-2/Bax值高于模型组(P<0.05)。模型组大鼠晶状体中p-MKK6和p-p38 MAPK蛋白表达水平,p-MKK6/MKK6和p-p38 MAPK/p38 MAPK高于对照组(P<0.05);治疗后干预组p-MKK6、p-p38 MAPK蛋白表达水平,p-MKK6/MKK6和p-p38MAPK/p38MAPK低于模型组(P<0.05)。结论 金樱子滴眼液能够改善糖尿病性白内障大鼠晶状体混浊程度,保护晶状体,抑制细胞凋亡,延缓病情进展,其机制可能与抑制氧化应激介导的p38 MAPK信号通路相关。