TLR_4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用及其机制,为神经退行性疾病(ND)的发病机制与防治研究提供新的实验依据。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实验1设正常对照组、LPS组及TLR4抗体+LPS组;免疫荧光法检测P-P38,P-JNK的表达。实验2分为6组:正常对照组,LPS组,TLR4抗体+LPS组,SB202190(抑制P38)+LPS组,SP600125(抑制JNK)+LPS组,PD98059(抑制ERK)+LPS组;分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后再给以LPS刺激24 h,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Active-caspase-3的表达变化;流式细胞术检测海马神经元凋亡率。结果:LPS组海马神经元P-P38、P-JNK的表达明显高于正常对照组(P<0.01),TLR4抗体+LPS组P-P38,P-JNK表达显著低于LPS组(P<0.01)。与正常对照组相比,LPS组海马神经元Bcl-2/Bax表达减少、Active-caspase-3表达增加,海马神经元凋亡率增加(P<0.01)。而TLR4抗体+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组Bcl-2/Bax显著高于LPS组、Active caspase-3显著低于LPS组(P<0.01),海马神经元凋亡率显著低于LPS组(P<0.05,P<0.01)。PD98059+LPS组与LPS组海马神经元凋亡率无明显差异。结论:1海马神经元中有TLR4介导的P38/JNK信号通路。2海马神经元TLR4激活后,P-P38、P-JNK表达增加,使Bcl-2/Bax的比例降低和Active-caspase-3表达增加,从而促进海马神经元的凋亡。海马神经元凋亡过程中有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与。

芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的MAPK/p38/JNK/ERK信号通路的研究

目的探讨芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的MAPK/p38/JNK/ERK信号通路的研究。方法随机将大鼠分为假手术组(Sham)和心肌缺血再灌注组(I/R),后者又分为:模型组(I/R),芪参益气高剂量组(QSYQ-H)和低剂量组(QSYQ-L);血流动力学检测左心室收缩压峰值(LVSP)及左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax);ELISA法检测血浆中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测心肌细胞p38,JNK,ERK mRNA和蛋白的水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠LVSP和±dp/dtmax明显较低(P<0.01);与模型组相比,芪参益气滴丸高低剂量组大鼠LVSP和±dp/dtmax均显著升高,且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应,差异有统计学意义(P<0.01);与假手术组比较,模型组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显升高(P<0.01);与模型组相比,芪参益气滴丸高低剂量组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显降低,且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应,差异有统计学意义(P<0.01);与假手术组相比,模型组对大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA和蛋白含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,芪参益气滴丸高低剂量组大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA和蛋白含量明显升高,且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论芪参益气滴丸能减小大鼠心肌缺血再灌注的损伤程度,有可能是通过p38/JNK/ERK激活,抑制炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。

胡桃醌通过p38/JNK MAPK信号通路调控口腔鳞癌Tac8113细胞增殖和凋亡

目的:探讨胡桃醌通过p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调控口腔鳞癌Tac8113细胞增殖和凋亡。方法:体外培养口腔鳞癌Tac8113细胞,分别给予终浓度为0,5,10,20μmol·L^-1的胡桃醌,继续培养24 h,检测细胞增殖、细胞凋亡和活性氧(ROS)水平,同时检测Tac8113细胞中p38、p-p38、JNK、p-JNK和Caspase-3蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,给予胡桃醌处理后,Tac8113细胞增殖率降低,Tac8113细胞凋亡率和ROS水平增加(P<0.05),且随着胡桃醌剂量增加,细胞增殖率、凋亡率和ROS变化越显著(P<0.05)。与空白对照组比较,给予胡桃醌处理后,Tac8113细胞p38和JNK蛋白表达变化不显著(P>0.05);p-p38、p-JNK和Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05),且随着胡桃醌剂量增加,增加越显著(P<0.05)。结论:胡桃醌可能通过激活p38/JNK MAPK信号通路来诱导Tac8113细胞凋亡,从而达到抑制Tac8113细胞的目的。

槲皮素对口腔鳞癌细胞增殖凋亡等细胞生物学行为及p38/JNK MAPK信号通路的影响

目的:探讨槲皮素对口腔鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及p38/JNK MAPK信号通路的影响。方法:以体外培养的口腔鳞癌Tac8113细胞为研究对象,分别设置空白对照组,槲皮素低剂量组(25μmoL/L)、高剂量组(50μmoL/L)及阳性对照组(顺铂4μg/mL)。CCK-8法检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞增殖的影响;流式细胞仪检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞凋亡的影响;Transwell实验检测槲皮素对口腔鳞癌Tac8113细胞迁移、侵袭的影响;WB法检测p38/JNK MAPK信号通路相关蛋白表达。结果:与空白对照组相比,槲皮素低、高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数及侵袭数均下降,凋亡率增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比,槲皮素高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数及侵袭数均下降,凋亡率增加(P<0.05),呈现剂量依赖性;槲皮素高剂量组及阳性对照组Tac8113细胞增殖活力、迁移数、侵袭数及凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,槲皮素低、高剂量组p-p38、p-JNK及Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比,槲皮素高剂量组p-p38、p-JNK及Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05),呈现剂量依赖性;空白对照组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、阳性对照组p38、JNK蛋白表达差异不显著(P>0.05)。结论:槲皮素可以降低口腔鳞癌Tac8113细胞的增殖活力、迁移和侵袭数,诱导Tac8113细胞凋亡,这可能是通过激活p38/JNK MAPK信号通路实现的。

DLEU1通过调控p38/JNK信号通路促进高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖和血管重塑的实验研究

目的:探讨淋巴细胞白血病缺失基因1(DLEU1)促进高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和血管重塑的机制及相关信号通路。方法:将12只DLEU1转基因大鼠(DTRs)随机分为DTRs组、p38组、JNK组,每组4只,分别经腹腔注射二甲基亚砜溶液、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125,并以Wistar大鼠(4只)为对照组,采用苏木精-伊红(HE)染色确定主动脉、心脏和肾脏的形态结构。通过转染DLEU1过表达质粒,构建DLEU1过表达的VSMCs,同时给予SB203580、SP600125干预,通过溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)实验、细胞周期及迁移实验比较不同干预细胞的生物活性的差异。结果:DTR组大鼠血管腔面积显著减小、中膜增厚,肾组织中可见小动脉增生,血管壁和肾小球增厚,p38及JNK抑制剂可减轻DLEU1介导的血管中膜增厚的效应,增加中膜/管腔面积比,肾脏小动脉的病理改变也有所改善。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测显示,转染过表达DLEU1质粒后,VSMCs中DLEU1的相对表达量显著提高(P<0.05),表明细胞模型构建成功。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测发现,磷酸化p38和JNK蛋白的表达上调。DLEU1过表达导致细胞增殖率显著增加。经p38和JNK抑制剂处理后,细胞增殖率均有所下降(P<0.05)。p38和JNK抑制剂可显著阻断细胞周期,处理后,G0/G1期细胞比例均有所上升。过表达DLEU1可显著提高细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的蛋白表达水平,而阻断p38和JNK可部分消除DLEU1对MMP-2和MMP-9蛋白表达的促进作用。Western Blot检测显示,DLEU1过表达细胞骨桥蛋白(OPN)蛋白表达水平明显上调,平滑肌22α(SM-22α)蛋白表达显著下调,经p38抑制剂和JNK抑制剂干预后,OPN蛋白表达水平明显降低,SM-22α蛋白表达水平上调。结论:高血压时DLEU1介导的VSMCs增殖和表型改变需要p38/JNK通路介导。

p38/JNK MAPK信号通路对MEHP致小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响

目的探讨p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]致小鼠睾丸间质(TM-3)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法将对数生长期的TM-3细胞分别暴露于p38抑制剂SB203580(5、10、20、40μmol·L^(-1))、JNK抑制剂SP600125(2.5、5、10、20μmol·L^(-1))24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,确定后续SB203580及SP600125干预组染毒剂量;将TM-3细胞分别暴露于0、200、400、800μmol·L^(-1) MEHP、10μmol·L^(-1) SB203580+400μmol·L^(-1) MEHP和10μmol·L^(-1) SP600125+400μmol·L^(-1) MEHP溶液24 h后,光镜下观察细胞形态;CCK-8法检测细胞活性;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况;荧光探针DCFH-DA法检测细胞活性氧(ROS)水平;免疫印迹法(Western blot)检测细胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平。结果与对照组相比,200、400、800μmol·L^(-1) MEHP剂量组ROS水平、凋亡率均升高(P均<0.05),细胞内p38和JNK蛋白表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05),蛋白p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3表达均增高(P均<0.05),且随着MEHP染毒剂量的升高,增高越明显(P均<0.05)。与400μmol·L^(-1) MEHP剂量组相比,SB203580干预组和SP600125干预组贴壁细胞数量增多,细胞间隙减小,细胞增殖率上升,细胞凋亡率和ROS水平均降低(P均<0.05),p38和JNK蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05),p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达均减少(P均<0.05)。结论MEHP可通过激活p38/JNK MAPK信号通路诱导TM-3细胞凋亡。

苏木提取物对动脉粥样硬化模型ApoE-/-小鼠氧化应激作用及对p38/JNK/ERK的影响

目的:通过建立动脉粥样硬化小鼠模型,观察苏木提取物对氧化应激的影响,并明确与p38/JNK/ERK信号通路的关系,进而探讨苏木提取物抗AS的作用机制。方法:所有小鼠适应性饲养2周后,将40只ApoE-/-小鼠随机分为,模型组、苏木提取物低、中、高剂量组,每组10只;10只相同遗传背景的C57BL/6J小鼠设为空白组,其中空白组小鼠给予普通饲料喂养,其余四组小鼠给予高脂饲料喂养8周进行模型复制,第9周开始灌胃,连续灌胃4周,12周后分离小鼠主动脉根部,制备石蜡切片,油红O染色观察小鼠主动脉窦脂质沉积情况;ELISA法检测小鼠主动脉中MDA、GSH-Px、SOD水平;Western blot法检测小鼠主动脉中p38、JNK、ERK蛋白磷酸化的表达。结果:苏木提取物低、中、高剂量组够降低AS模型小鼠主动脉窦脂质沉积水平;降低小鼠主动脉中MDA水平,升高主动脉中GSH-Px、SOD水平;并可下调小鼠主动脉中p38、JNK、ERK蛋白磷酸化的表达。结论:苏木提取物能够通过抗氧化应激途径发挥抗AS的作用,部分机制可能与抑制p38/JNK/ERK信号通路活化有关。

术前应用甲壳素衍生物对瘢痕疙瘩组织中TSG6-P38/JNK信号通路的影响

目的探究术前应用甲壳素衍生物对瘢痕疙瘩中肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)-p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的影响。方法选择自2019年10月至2021年8月,河北北方学院附属第一医院皮肤科收治的79例瘢痕疙瘩患者作为研究对象,接受手术切除治疗并根据术前是否使用甲壳素衍生物分为甲壳素组(42例)和对照组(37例),甲壳素组术前给予甲壳素凝胶涂抹,2次/d,连续14 d;对照组术前不接受任何治疗。手术中收集瘢痕疙瘩组织,采用HE染色检测病理改变,Western blot检测PCNA、Ki-67、TSG6、p-p38、p-JNK、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解型caspase-3(Cleaved caspase-3)的表达水平,采用TUNEL法检测细胞凋亡率。结果与对照组比较,甲壳素组瘢痕疙瘩中炎症细胞浸润减少,PNCA、Ki-67、Bcl-2的表达水平降低,细胞凋亡率及TSG-6、Bax、Cleaved caspase-3的表达水平增加(P<0.05)。结论甲壳素衍生物调控瘢痕疙瘩中的细胞增殖及凋亡,这一作用与调控TSG6-p38/JNK通路有关。

盐酸戊乙奎醚对脂多糖诱导气道平滑肌细胞炎性损伤及P38MAPK/JNK通路的影响

目的:探讨盐酸戊乙奎醚(PHC)对脂多糖(LPS)诱导气道平滑肌细胞(ASMC)炎性损伤及P38MAPK/JNK通路的影响。方法:体外培养人ASMC,将ASMC随机分成5组。对照组只含ASMC;LPS组在ASMC中加入终质量浓度为500 ng·ml-1LPS;1、10、100μmol·L-1PHC+LPS组分别在LPS组基础上加入终质量浓度为1、10、100μmo·L-1PHC。采用CCK-8法检测ASMC增殖情况;显微镜下观察细胞形态学变化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测ASMC细胞因子乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)水平;采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western blotting检测凋亡及P38MAPK/JNK通路相关蛋白表达情况。结果:与对照组相比,LPS组ASMC 48 h时的吸光度(A)值显著降低(P <0.05),细胞体积扁小,形态偏圆,胞质空亮,胞质内出现大小不等的颗粒,细胞因子LDH、MDA水平均显著升高(P <0.05),细胞凋亡率显著升高(P <0.05),抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P <0.05),促凋亡基因Bax蛋白表达水平显著升高(P <0.05),p-JNK、p-P38蛋白表达水平显著升高(P <0.05);给予PHC处理后,与LPS组相比,1、10、100μmol·L-1PHC+LPS组细胞48 h时的A值均显著升高(P <0.05),细胞无明显形态学变化,且贴壁细胞数量多,细胞因子LDH、MDA水平均显著降低(P <0.05),细胞凋亡率显著降低(P <0.05),抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P <0.05),促凋亡基因Bax蛋白表达水平显著降低(P <0.05),P-JNK、P-p38蛋白表达水平显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖性。结论:PHC可抑制LPS诱导的ASMC炎性损伤,其机制可能与抑制P38MAPK/JNK通路的活化有关。

基于Akt/JNK/p38 MAPK信号通路探讨健脾活骨方对酒精致血管内皮细胞功能损伤的保护作用

目的:观察健脾活骨方(JPHGP)对酒精致血管内皮细胞功能损伤的保护作用,并基于蛋白激酶B/c-Jun氨基末端激酶/p38 MAPK(Akt/JNK/p38 MAPK)信号通路探索相关作用机制。方法:通过鸡胚尿囊膜实验、胸主动脉环实验和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移、侵袭、黏附和管腔形成实验,在有或无酒精诱导条件下,观察JPHGP不同质量浓度8、16、32μg·L^(-1)对血管新生的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HUVEC中Akt、JNK、p38 MAPK等磷酸化表达水平。结果:与正常组比较,模型组动脉环周围微血管数目及长度均减少,HUVEC的迁移、侵袭、和管腔形成能力降低(P<0.05,P<0.01);JPHGP16、32μg·L^(-1)组作用后能明显升高鸡胚尿囊膜新生血管长度(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,JPHGP 8、16、32μg·L^(-1)组能浓度依赖地增加胸主动脉环周围微血管数量(P<0.05,P<0.01),JPHGP 32μg·L^(-1)组能升高胸主动脉环周围微血管长度(P<0.05);JPHGP 16、32μg·L^(-1)组均能增强HUVEC的迁移、侵袭、和管腔形成能力。Western blot检测结果表明,与正常组比较,模型组中的p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-Akt/Akt蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);与模型组比较,JPHGP 8、16、32μg·L^(-1)组的p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-Akt/Akt蛋白表达水平均显著升高(P<0.01),JPHGP 16、32μg·L^(-1)组的p-JNK/JNK的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论:JPHGP对酒精致血管内皮细胞功能损伤具有保护作用,其机制可能与激活Akt/JNK/p38MAPK信号通路有关,相关研究结果将为JPHGP“健脾活血”功效阐明提供一定的科学依据。

肿瘤内神经新生在口腔鳞状细胞癌进展中的作用及机制

目的探讨肿瘤内神经新生在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)进展中的作用及其机制。方法利用免疫组化方法在167例人OSCC组织检测泛神经标记物蛋白基因产物(PGP) 9. 5表达;采用Transwell小室实验检测神经递质降钙素基因相关肽(CGRP)对人舌鳞癌细胞株TSCCA细胞迁移和侵袭的影响;利用免疫印迹方法观察CGRP对TSCCA细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化的影响;进而观察ERK/p38/JNK抑制剂对CGRP诱导TSCCA细胞迁移和侵袭的影响。结果 88%的OSCC组织中表达PGP9. 5,主要分布在肿瘤间质中; PGP9. 5中/强阳性表达与肿瘤的分级(r=0. 425,P<0. 001)、神经浸润(r=0. 166,P<0. 05)及患者短生存期(r=0. 186,P<0. 05)呈正相关。CGRP引起TSCCA细胞的迁移数目增加(CGRP:165. 4±14. 2,对照:110. 2±5. 3,P<0. 001),侵袭数目也增加(CGRP:68. 3±23. 5,对照:12. 8±2. 8,P<0. 001); CGRP处理TSCCA细胞后,1 h引起p-ERK的表达上调(P<0. 001),6 h引起p-p38的表达上调(P<0. 05),24 h引起p-JNK的表达上调(P<0. 05);与对照组相比,JNK抑制剂SP600125引起的TSCCA细胞的迁移数目减少(SP600125:94. 5±15. 5,对照:142. 5±20. 8,P<0. 05),侵袭数目也减少(SP600125:52. 5±16. 5,对照:118. 4±38. 1,P<0. 05)。结论 OSCC神经新生与疾病的进展密切相关,神经递质CGRP可能通过磷酸化JNK促进OSCC细胞的迁移和侵袭,从而促进OSCC的进展。

藁本内酯对帕金森病细胞模型的保护作用及其机制研究

目的研究藁本内酯对帕金森病细胞模型的保护作用及其作用机制。方法取对数生长期的SK-N-SH细胞使用200μmol·L^(-1)的MPP+处理48 h,构建帕金森病细胞模型;以正常培养基培养的细胞作为对照组。藁本内酯组加入终浓度为30.0μmol·L^(-1)藁本内酯进行培养;P79350组加入30.0μmol·L^(-1)的藁本内酯后,实验结束前1 h加入50μmol·L^(-1)的P79350处理细胞;对照组和MPP+组加入不含药物的培养基培养。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;以流式细胞术检测细胞周期情况和细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(p38 MAPK/JNK)信号通路和增殖、凋亡相关蛋白的表达水平。结果对照组、MPP+组和10.0、20.0、30.0、50.0、100.0和200.0μmol·L^(-1)藁本内酯组的细胞存活率分别为(100.00±1.91)%、(35.63±3.40)%、(49.06±3.78)%、(54.08±6.63)%、(91.61±4.43)%、(79.87±6.15)%、(64.73±7.64)%和(42.99±6.09)%。藁本内酯可明显抑制MPP+诱导引起的p38 MAPK/JNK信号通路的激活,并明显抑制MPP+组细胞G0/G1期转变。对照组、MPP+组、藁本内酯组和P79350组细胞凋亡率分别为(4.66±0.68)%、(21.22±1.98)%、(10.43±0.96)%和(15.32±1.41)%。与MPP+组细胞相比,藁本内酯作用后可明显促进细胞中Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白的表达,而明显抑制Bcl-2相关X(Bax)蛋白和裂解的胱天蛋白酶-3(Cl-caspase-3)蛋白的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论藁本内酯对帕金森病细胞模型具有保护作用,可增强细胞活力,抑制细胞凋亡,主要与抑制p38 MAPK/JNK信号通路的激活有关。