龙血素B通过P38MAPK信号通路调控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的机制

目的:探究龙血素B对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化和骨形成的影响以及其通过P38MAPK信号通路调控成骨分化和骨形成的机制。方法:培养MC3T3-E1细胞,加入不同浓度(0、15、30、60、90、120μmol/L)龙血素B,采用CCK8法和流式细胞术(FCM)检测不同时间(24h、48h、72h)MC3T3-E1细胞增殖能力和凋亡情况,确定龙血素B促MC3T3-E1细胞成骨最佳的药物浓度及作用时间。培养MC3T3-E1细胞并分为空白组(不作干预),龙血素B组(加入龙血素B共培养),龙血素B+阻断剂组(加入龙血素B和P38抑制剂SB203580共培养),进行干预实验;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组细胞ALP活性,qRT-PCR法检测各组细胞骨桥蛋白(OPN)基因、骨钙素(OCN)基因、骨唾液蛋白(BSP)基因表达水平,茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。结果:龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,效果与浓度和干预时间相关,在90μmol/L浓度下干预48h促MC3T3-E1细胞生长作用最强;干预结束后第1、3、5天,龙血素B组细胞ALP活性较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞ALP活性较龙血素B组降低(P<0.05);龙血素B组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较龙血素B组降低(P<0.05);干预结束后第21天,龙血素B组细胞钙化结节区域面积较空白组增大,龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组减小(P<0.05)。结论:龙血素B可提高MC3T3-E1细胞增殖活性,并通过激活P38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成。

基于p38/p-STAT1(s727)信号通路探讨阳和汤对人乳腺癌细胞的影响

目的以p38/p-STAT1(s727)信号通路为基础,探究阳和汤含药血清对乳腺癌BT549细胞的影响,并探讨其可能的作用机制。方法制备阳和汤药液,将SD大鼠随机分为空白组(蒸馏水),阳和汤低、中、高剂量组(4.5、9、18 g·kg^(-1))灌胃后制备阳和汤含药血清。各组按10%含药血清和90%RMPI-1640完全培养基均匀混合,对细胞进行干预。用MTT法检测细胞生长抑制率;划痕实验观察BT-549细胞迁移情况;Western blot检测细胞内p38、p-p38、p-STAT1(s727)、p21、CDK4的表达情况。结果MTT实验表明,与空白对照组相比,阳和汤各剂量组及阳性药物组细胞生长抑制率均增加,呈时间与剂量依赖性(P<0.01);阳和汤含药血清干预BT-549细胞后,与空白对照组相比,阳和汤低、中、高剂量组在12 h及24 h的划痕愈合率逐渐降低(P<0.01);Western blot实验表明,阳和汤低、中、高剂量组细胞内p38表达无明显差异,细胞内p-p38、p-STAT1(s727)、p21表达升高,而CDK4表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论阳和汤含药血清可以显著抑制乳腺癌细胞BT-549增殖,抑制细胞迁移,其内在机制可能与p38/p-STAT1(s727)信号通路的激活有关。

抗奥合剂通过p38 MAPK/NF-κB信号通路和ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解急性肺损伤研究

目的探讨抗奥合剂(KAHJ)治疗小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制,为其可能作为缓解新型冠状病毒(COVID-19)感染后症状的药物提供依据。方法采用网络药理学方法预测KAHJ治疗ALI的主要活性成分、潜在靶点和相关信号通路。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+KAHJ组。LPS+KAHJ组小鼠灌胃KAHJ(4.76 g·kg^(-1)·d^(-1),8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1)),其余组小鼠灌胃生理盐水(8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1))。14 d后,腹腔注射LPS(5 mg·kg^(-1))诱导ALI模型。收集小鼠血清和肺组织,通过组织病理学观察肺组织的病理变化。采用Western blot、qPCR、ELISA和IHC等方法评估KAHJ对ALI的改善作用。结果通过网络药理学筛选出疾病和药物共同的70个核心靶基因,并显示与多个信号通路密切相关,如MAPK、NF-κB、Apoptosis、COVID-19和肾素-血管紧张素系统(Ras)信号通路等。此外,通过实验验证发现KAHJ能改善小鼠ALI后的炎症和细胞凋亡,减少肺损伤和肺水肿,抑制肺纤维化。同时,KAHJ的作用机制与p38 MAPK和NF-κB的磷酸化以及ACE2/Ang1-7/Mas轴的调控也有着密切关系。结论KAHJ可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路和调控ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解ALI,为缓解COVID-19感染后症状提供了补充和替代药物。

四逆汤饼灸对兔膝骨关节炎软骨中Caveolin-1/p38 MAPK信号通路蛋白表达的影响

目的探讨四逆汤饼灸治疗膝骨关节炎(KOA)的作用机制。方法取新西兰兔50只,随机分为对照组、模型组、p38 MAPK抑制剂(抑制剂)组、四逆汤饼灸组、四逆汤饼灸联合p38 MAPK抑制剂(联合)组,每组10只。除对照组外,其他组采用右后肢膝关节伸直位石膏管型固定制备兔KOA模型。对照组、模型组不予治疗;抑制剂组于关节腔内注射p38 MAPK抑制剂TAK-715,1次/d,治疗2周;四逆汤饼灸组取鹤顶、内外膝眼穴位予以四逆汤饼灸治疗,1次/d,治疗2周;联合组于关节腔内注射p38 MAPK抑制剂TAK-715,并在鹤顶、内外膝眼穴位予以四逆汤饼灸治疗,1次/d,治疗2周。采用HE染色观察软骨病理变化,免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法(Western blot)检测软骨组织中Caveolin-1、p38 MAPK、MMP-13蛋白的表达。结果HE染色结果显示,模型组软骨表面明显粗糙,破坏严重,细胞排列紊乱,Mankin’s评分明显升高;抑制剂组、四逆汤饼灸组及联合组软骨表面较光滑,软骨细胞分布较均匀,Mankin’s评分降低。免疫组化与Western blot结果显示,与对照组比较,模型组软骨组织中Caveolin-1、p38 MAPK、MMP-13的表达均升高(P均<0.05);与模型组比较,抑制剂组、四逆汤饼灸组及联合组软骨组织中Caveolin-1、p38MAPK、MMP-13的表达均降低(P均<0.05)。结论四逆汤饼灸能延缓KOA软骨的进一步破坏,其机制可能与抑制Caveolin-1/p38 MAPK信号通路蛋白的表达有关。

基于TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路探讨心衰康胶囊对糖尿病大鼠心肌纤维化的改善作用

目的探究心衰康胶囊是否通过调控TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路改善糖尿病大鼠心肌纤维化。方法清洁SPF级雄性大鼠32只,随机分为对照组、模型组、心衰康胶囊组(1.0 g·kg^(-1)·d^(-1))、缬沙坦组(30 mg·kg^(-1)·d^(-1))。除对照组外,按30 mg/kg体质量腹腔注射浓度为1 mg/mL的链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型大鼠,对照组和模型组均0.9%氯化钠溶液灌胃。采用苏木素-伊红(HE)染色观察糖尿病大鼠心肌组织病理变化;免疫组织化学法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达水平;酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测大鼠TGF-β1、大鼠B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白水平;Western Blot法检测心肌组织中TGF-β1、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38抗体(p-p38MAPK)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)蛋白表达水平的变化。结果与对照组比较,模型组大鼠心肌排列紊乱,组织肿胀,有大量炎性细胞浸润,Bcl-2、p-CREB蛋白表达水平明显降低(P<0.01),TGF-β1、Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,心衰康胶囊组大鼠心肌纤维排列较整齐,炎性浸润减少,组织间隙无明显水肿,TGF-β1、p-p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05),p-CREB、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01)。结论心衰康胶囊可抑制糖尿病大鼠的心肌纤维化以及细胞凋亡,其改善作用可能与调控TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路有关。

基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信号通路与糖尿病足免疫表达关系的研究

目的观察烧伤皮肤再生医疗技术[湿润暴露疗法(MEBT)/湿润烧伤膏(MEBO)]对糖尿病足部创面组织细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和p38信号通路分子及免疫表达的调控作用及关系,探讨MEBT/MEBO对糖尿病足溃疡的修复机制。方法糖尿病足患者40例予MEBT/MEBO干预治疗,留取治疗前后创面组织行免疫组化检测ERK1/2和p38信号通路关键分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK6)、原癌基因(c-myc)、Akt、活化复制因子2抗体(ATF2)及免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c表达情况,并观察二者间关系。结果经MEBT/MEBO治疗后,39例患者足部创面面积有不同程度缩小,仅1例患者无明显变化,显效14例(35.00%),有效25例(62.50%),无效1例(2.50%)。治疗前后信号通路分子全阳性表达、免疫阳性表达(任一指标)及免疫阳性表达(具体指标)比较差异均有统计学意义(P<0.05),在创面信号通路分子表达阳性率升高的同时,免疫因子阳性表达率亦升高。治疗前创面组织可见免疫因子极少量分布,治疗后创面组织免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c呈广泛、弥漫分布。治疗前创面组织可见信号分子极少量分布,治疗后创面组织信号通路分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2呈广泛、弥漫分布。结论 MEBT/MEBO可能促进了糖尿病足创面ERK1/2和p38信号通路分子及免疫表达,ERK1/2和p38信号通路及其交互作用可能通过增加创面组织免疫表达而促进了糖尿病足创面的愈合。

尿毒清颗粒对糖尿病肾病大鼠肾脏抗炎抗氧化保护作用及对TGF-β_1/p38MAPK信号通路影响的研究

目的探讨尿毒清胶囊对糖尿病肾病大鼠的抗炎、抗氧化作用及对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β_1/p38MAPK信号通路的影响。方法 70只雄性SD大鼠,随机分为10只正常组,60只模型组。模型组大鼠腹腔注射45 mg·kg^(-1)链脲佐菌素(STZ)造模,取造模成功的60只大鼠随机分为12只模型组,12只厄贝沙坦阳性组,12只尿毒清颗粒低剂量组(0.04 mg·kg^(-1)),12只尿毒清颗粒中剂量组(0.08 mg·kg^(-1)),12只尿毒清颗粒高剂量(0.16 mg·kg^(-1)),灌胃给药12周,模型组和空白组给予生理盐水。每周称量体质量,每周检测24 h尿蛋白量。给药治疗12周后,取血检测血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;麻醉处死大鼠,各取8只对肾组织行HE染色,观察肾组织的病理形态;并取肾组织进行RT-PCR和免疫组化观察TGF-β_1/p38MAPK信号转导等转化因子的mRNA及蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠尿蛋白及血清BUN、SCr、TG、MDA含量显著增高(P<0.05),NO、SOD含量显著降低(P<0.01),肾组织胞浆中TGF-β_1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05);通过治疗后,与模型组对比,尿毒清颗粒高剂量组和阳性组肾脏病理损害明显减轻,尿蛋白及血清BUN、SCr、TG、MDA含量显著降低(P<0.05),NO、SOD含量明显增高(P<0.05),肾组织内TGF-β_1、p38MAPK、Caspase-3 m RNA及蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论尿毒清颗粒能降低24 h尿蛋白量,降低TG和MDA含量及升高NO、SOD含量,通过调控TGF-β_1/p38MAPK从而治疗糖尿病肾病的肾组织受损部位,改善肾功能和减轻病理损伤,能有效地保护糖尿病肾病组织。

硒对糖尿病患者的内皮细胞表达P38信号通路和MCP-1的影响

目的:探讨P38MAPK和MCP-1的关系及其在糖尿病动脉粥样硬化中的作用以及硒的作用机制。方法:分别以高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、胰岛素或过氧化氢体外孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并以Westernblot法或RT-PCR法检测P38MAPK和MCP-1在HUVEC的表达。检测并比较有无P38MAPK特异抑制剂SB203580或硒预处理,以上4种因素对P38MAPK和MCP-1在HUVEC表达的影响。结果:高葡萄糖、AGE、胰岛素或过氧化氢均可独立激活P38MAPK,并增加MCP-1在HUVEC的表达。SB203580显著抑制MCP-1的表达。硒抑制P38MAPK的活化并减少MCP-1的表达。结论:P38MAPK是MCP-1的上游信号分子,表明P38MAPK可能是糖尿病动脉粥样硬化发生的始动信号之一。硒可能通过抑制P38MAPK磷酸化而抑制MCP-1表达,有预防动脉粥样硬化作用。

P38信号通路对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 探讨P38信号通路 (P38MAPK)和单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)的关系 ,以及P38MAPK在糖尿病 (DM )动脉粥样硬化 (AS)中的作用。 方法 分别以高葡萄糖 (HG)、糖基化终产物 (AGEs)、高胰岛素 (HIns)和过氧化氢 (H2 O2 )孵育人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) ,观察HUVECsP38MAPK的蛋白表达和MCP 1mRNA表达 ;以P38MAPK特异抑制剂SB2 0 35 80预处理 ,再用以上4种刺激因素孵育HUVECs,观察MCP 1mRNA在HUVECs的表达。 结果 HG、AGEs、HIns和H2 O2 均可独立激活P38MAPK ,使磷酸化P38MAPK蛋白表达量及MCP 1mRNA表达量增加 ;SB2 0 35 80预处理后 ,MCP 1mRNA表达被明显抑制。 结论 P38MAPK调控MCP 1的表达 ,表明P38MAPK可能是DM致AS发生的始动信号之一。

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶1、2表达的影响

目的:探讨牙髓卟啉单胞菌(P.e)脂多糖(LPS)对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞ERK1/2和p38表达的影响。方法:用10μg/mL的P.e-LPS分别作用于成骨细胞0、5、15、30、60、180 min,应用蛋白质印迹技术检测成骨细胞内磷酸化ERK1/2和p38表达水平的变化。采用SPSS11.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验。结果:10μg/mL的P.e-LPS刺激后,成骨细胞内p38迅速被活化,5～30 min为激活高峰(P<0.01),60 min后基本恢复至正常水平;ERK1/2磷酸化水平在P.e-LPS刺激5 min后明显增加,15 min后磷酸化水平最高(P<0.01),30 min后磷酸化水平下降。结论:P.e-LPS可诱导成骨细胞MC3T3-E1的p38和ERK1/2蛋白表达增强,Pe-LPS可能通过p38和ERK1/2对成骨细胞发挥作用。

金纳多注射液对肾缺血再灌注损伤诱导的PI3K/AKT及ASK1/p38信号通路的影响

目的研究银杏叶提取物金纳多(Ginaton)注射液防治肾脏缺血再灌注损伤及其分子机制。方法 SD大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组(肾I/R组)和药物组3个组。药物组术前连续3 d腹腔注射金纳多注射液(50 mg.kg-)1。采用双侧夹闭大鼠肾蒂的方法制备动物模型。观察肾功能、肾组织丙二醛(MDA)水平和肾脏病理改变。TUNEL及流式细胞术检测肾细胞凋亡。Western blot分析磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K/AKT),凋亡信号调节激酶1(ASK1);p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)的激活与表达。结果 (1)与假手术组相比,缺血再灌注组AKT、ASK1及p38MAPK的活性均明显增强,凋亡的细胞数量增加。(2)与缺血再灌注组相比,金纳多组大鼠的血清Scr、BUN、肾组织MDA水平、细胞凋亡百分率及凋亡细胞的数量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);金纳多组AKT的活性显著增强,ASK1、p38的活性明显低于缺血再灌注组(P<0.05)。结论金纳多能抑制肾缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡,减轻肾组织病理及脂质过氧化损伤,改善缺血再灌注损伤。其作用机制与上调抗凋亡信号通路(PI3K)/AKT通路的激活,负调凋亡信号通路ASK1/p38通路的激活有密切关系。

吡格列酮对新生大鼠成骨细胞p38和ERK1/2信号通路的影响

目的观察吡格列酮对新生大鼠成骨细胞增殖、凋亡及分化的影响,并初步探讨相关分子机制。方法获取新生大鼠颅骨成骨细胞,应用倒置显微镜观察并通过茜素红染色鉴定。将第3代成骨细胞接种至含不同浓度吡格列酮(0、10、20、40μmol/L)的培养基中培养。应用MTT实验检测成骨细胞活性。应用Hoechst33258染色检测细胞凋亡。应用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和钙结节染色评估吡格列酮对成骨细胞分化能力的影响。应用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹评估吡格列酮对成骨细胞内BMP-2、Runx2、OSX等成骨分化相关基因和蛋白表达的影响。应用蛋白免疫印迹评估p38和ERK1/2信号通路内相关蛋白表达情况。结果随着吡格列酮(0、10、20、40μmol/L)浓度的增加,各组细胞活性逐渐降低(F=282.629,P<0.01)。与空白对照组(0μmol/L)相比,经10、20μmol/L吡格列酮处理组荧光阳性成骨细胞数量减少(P<0.05)。与空白对照组及吡格列酮10μmol/L组、20μmol/L组相比,吡格列酮40μmol/L组荧光阳性成骨细胞数量显著增多(P<0.05)。随着吡格列酮(0、10、20、40μmol/L)浓度的增加,各组细胞ALP活性逐渐降低(F=64.247,P<0.01)。随着吡格列酮浓度的增加,钙化结节数量逐渐增多(F=672.644,P<0.01)。与空白对照组相比,经10、20、40μmol/L吡格列酮处理后,细胞内BMP-2、Runx2、OSX mRNA和蛋白表达水平均以剂量依赖形式显著降低(P<0.05)。与空白对照组相比,经10、20、40μmol/L吡格列酮处理后,细胞内p-p38 MAPK蛋白表达水平均显著增加(P<0.05),而pERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。各组细胞内p-JNK蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论吡格列酮以剂量依赖的方式调节大鼠成骨细胞增殖、凋亡和分化,且p38信号通路活化和ERK1/2信号途径抑制在这一过程中起重要调控作用。

基于ERK1/2和p38 MAPK信号通路探讨温阳化饮方对支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠的作用机制

目的探讨温阳化饮方对支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠的作用以及对ERK1/2和p38 MAPK信号通路的调节作用。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、对照组、实验组(n=15);先以卵蛋白(OVA)致敏刺激和雾化进行造模形成支气管哮喘模型大鼠,后以冰水喂养给以“饮冷”刺激,冰箱冷冻给以“形寒”刺激进行寒饮蕴肺证造模。实验组和对照组大鼠以剂量为30 mg/kg的温阳化饮方和雷帕霉素溶液(以医用生理盐水进行溶解)进行灌胃给药,正常组和模型组以等剂量的医用生理盐水灌胃,连续灌胃22 d。小微动物肺功能分析仪测定大鼠的肺功能;TUNEL检测肺组织中的细胞凋亡;ELISA法检测血清中细胞因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;Western blot检测肺组织中p-ERK1/2、p-p38 MAPK、凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达。结果与正常组相比,模型组大鼠吸气时的气道阻力(Rinsp)和呼气时的气道阻力(Rexp),血清中IL-6和TNF-α的含量,细胞凋亡率,p-ERK1/2、p-p38 MAPK、Bax的表达出现明显升高,肺胸通气时的动态顺应性(Cdyn)、Bcl-2的表达出现明显下降(均P<0.05),与模型组相比,对照组和实验组大鼠Rinsp和Rexp、血清中IL-6和TNF-α的含量,细胞凋亡率,p-ERK1/2、p-p38 MAPK、Bax的表达出现明显下降,Cdyn、Bcl-2出现明显升高(均P<0.05)。结论在支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠模型中,温阳化饮方能明显抑制炎性因子的释放,降低肺组织的细胞凋亡,这可能与抑制ERK1/2和p38MAPK信号有关。

回回甘松饮含药血清对高糖培养的足细胞增殖作用及ROS/p38MAPK/TGF-β1信号通路的影响

目的观察回回甘松饮含药血清(HGY)对高糖诱导的足细胞(MPC5)细胞增值、细胞周期的影响。揭示HGY对ROS/p38MAPK/TGF-β1信号转导通路的作用机制,从而延缓早中期肾纤维化(RF)的进展。方法体外培养小鼠肾足细胞(MPC5)后分组:正常对照组(NC)、高糖组(HG)、坎地沙坦组(Y)、HGY高、中、低剂量组。除正常对照组以外,其余各组分别给予50 mmol/L葡萄糖+5%正常小鼠血清、50 mmol/L葡萄糖+坎地沙坦(20g/kg)组小鼠血清、50 mmol/L葡萄糖+HGY (5,10,20g/kg)组大鼠血清干预24小时。细胞培养结束后,采用CC-K8法检测细胞最佳的给药浓度及给药后细胞活力;采用流式细胞术测细胞周期;采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测ROS,p38MAPK,TGF-β1,FN,ColⅠ的蛋白表达水平。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组足细胞p38MAPKmRNA的表达水平。结果与正常组比较,高糖(50mmol/L)培养足细胞中ROS,p38MAPK,TGF-β1,FN,ColⅠ蛋白表达量均升高(P<0.05)。而经过不同浓度HGY含药血清及坎地沙坦干预后可下调高糖诱导的足细胞中ROS, p38MAPK, TGF-β1,FN,ColⅠ的蛋白表达量(P<0.05),且与坎地沙坦含药血清的调控结果接近,无显著差异。结论 HGY含药血清可调控MPC5在高糖环境下的ROS, p38MAPK,TGF-β1,FN,ColⅠ的蛋白表达水平,改善高糖诱导足细胞的损伤而减轻肾损害,延缓早期DN所致RF进程。

miR-146b-3p通过RAF1/p38MAPK/COX-2信号通路影响糖尿病发生脑梗死的机制研究

目的探讨miR-146b-3p通过RAF1/p38MAPK/环氧化酶-2(COX-2)信号通路影响糖尿病脑梗死的发生机制。方法选取我院2015年4月—2017年12月210例糖尿病病人为研究对象,通过随访研究调查病人发生血栓情况,有15例患有脑梗死,作为伴有糖尿病的脑梗死(DMCI)组,另选取15例无脑梗死病人为对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组病人白介素-6(IL-6)、COX-2含量;采用聚合酶链式反应(PCR)及免疫印迹方法检测相关基因的mRNA及蛋白表达。结果两组一般资料及相关指标比较差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,DMCI组血中IL-6和COX-2表达升高,但存在一定的局限性;IL-6诱导外周血单核细胞2 h后,COX-2的mRNA和蛋白表达明显增加,COX-2表达受IL-6调控;与对照组相比,miR-146b-3p mRNA在DMCI组表达低于正常组(0.16±0.07与1.12±0.16,P<0.001);与对照组相比,DMCI组RAF1 mRNA的表达增加(P<0.01),且其蛋白表达也增加;DMCI组中COX-2、p-p38MAPK表达增加,p38MAPK蛋白表达减少,说明DMCI病人激活了p38MAPK的信号通路;当用10 ng/mL的IL-6处理外周血单核细胞(PBMC)时,可激活STAT3磷酸化,且当IL-6处理PBMC 1 h后,miR-146b-3p mRNA表达下降,当IL-6处理12 h后,发现miR-146b-3p mRNA在IL-6处理12 h时(0.20±0.12)表达低于对照组(1.02±0.15,P<0.05),还发现IL-6处理中COX-2的mRNA(4.98±0.69)和蛋白质表达高于对照组;DMCI组中miR-146a mRNA表达降低,与miR-146b的表达趋势一致。结论miR-146b-3p的表达通过介导RAF/p38MAPK/COX-2信号通路与糖尿病病人脑梗死的发展密切相关,miR-146b-3p可作为糖尿病脑梗死病人检测和干预的新靶点。

夹脊电针对ALS-SOD1^(G93A)小鼠腰髓中p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响研究

目的探究p38 MAPK/NF-κB信号通路在夹脊电针治疗肌萎缩侧索硬化-超氧化物歧化酶1^(G93A)(ALS—SOD1^(G93A))转基因小鼠的作用机制。方法选取45只ALS-SOD1^(G93A)转基因阳性雌性小鼠为研究对象,随机分为模型组、手针组、电针组,每组各15只,另取15只同窝野生型雌性小鼠为对照组,小鼠60 d龄时开始实验:对照组、模型组每周给予捆绑固定20 min 2次,手针组给与普通针、电针组采用全能脉冲电疗仪给与电针治疗,每周2次刺激双侧L_(1～2)、L_(5～6)夹脊穴,共治疗4周。120 d取小鼠腰膨大L_(1～6)腰髓,采用尼氏染色、透射电镜观察进行形态学检测,采用免疫组织化学法检测p38、p-p38表达,免疫荧光检测p65核移位,蛋白免疫印迹法检测全称肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、核因子-κB抑制因子(IκB-α)、p38、p65、p-IκB-α、p-p38、p-p65的表达,实时定量PCR(qPCR)检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达。结果模型组神经元数目明显减少(P<0.05),手针组与电针组形态学均有较大改善、电针组改善更佳。模型组炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白及mRNA水平上升,与模型组及手针组比较,电针组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白及mRNA明显降低(P<0.05)。模型组检出大量p38、p-p38阳性细胞分布于脊髓灰质前角,与模型组比较,手针组与电针组p-p38表达减弱,电针组减弱程度更大;与对照组比较,模型组p-IκB-α、p-p65含量升高(P<0.05);与模型组相比,手针组与电针组p-IκB-α、p-p65含量下降(P<0.05)。手针组与电针组均抑制p65入核过程,其中电针组抑制更加明显。结论夹脊电针通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路,对腰髓前角运动神经元产生保护作用,缓解ALS病情的进展,为夹脊电针临床推广提供了理论依据。

七氟烷通过p38/Nrf2信号通路诱导HO-1基因表达抑制神经元凋亡

目的研究七氟烷诱导神经元血红素加氧酶1(HO-1)基因表达的信号转导通路,探讨七氟烷脑保护机制。方法将培养7d的新生Wistar大鼠海马神经元随机分为5组:正常培养组(C组)、氧糖剥夺组(D组)、2%七氟烷+氧糖剥夺组(S1组)、4%七氟烷+氧糖剥夺组(S2组)和4%七氟烷+SB203580+氧糖剥夺组(SB组)。C组神经元按正常培养方法培养。D组神经元进行缺糖、缺氧60min后复糖复氧后继续培养24h。S1组和S2组神经元分别给予2%或4%七氟烷预处理60min后同D组处理。SB组在神经元给予4%七氟烷处理同时在培养液中加入SB203580使其终浓度为10μmol/L后同S2组处理。收集神经元进行HO-1mRNA和p38、Nrf2、AP-1和HO-1蛋白表达的检测,检测神经元的存活率和凋亡率。结果与C组比较,D组神经元HO-1mRNA和HO-1蛋白表达增加(P<0.05),p38和Nrf2蛋白表达增加(P<0.05),AP-1蛋白表达表达增加(P<0.05),神经元存活率降低、凋亡率增加(P<0.01)。与D组比较,S1组神经元HO-1mRNA和HO-1蛋白表达增加(P<0.01),p38和Nrf2蛋白表达增加(P<0.01),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05),神经元存活率升高、凋亡率降低(P<0.01)。与S1组比较,S2组神经元HO-1mRNA和HO-1蛋白表达增加(P<0.05),p38和Nrf2蛋白表达增加(P<0.05),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05),神经元存活率升高、凋亡率降低(P<0.01)。与S2组比较,SB组神经元HO-1mRNA和HO-1蛋白表达降低(P<0.01),p38和Nrf2蛋白表达降低(P<0.01),AP-1蛋白表达表达变化不明显(P>0.05),神经元存活率降低、凋亡率升高(P<0.01)。结论七氟烷通过p38/Nrf2信号通路诱导神经元HO-1mRNA表达,抑制氧糖剥夺神经元的凋亡。

比索洛尔通过ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路改善缺血再灌注诱导的H9C2心肌细胞损伤的研究

目的:探讨比索洛尔对缺血再灌注(I/R)诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,将H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、缺氧/复氧(H/R)模型组(Model组)、比索洛尔组(Bisoprolol组)、比索洛尔+凋亡信号调节激酶1(ASK1)重组蛋白组(Bisoprolol+ASK1组)。除Control组外,其余各组H9C2心肌细胞均进行H/R损伤处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测细胞活力;采用流失细胞术检测细胞凋亡;采用酶联免疫吸附试验检测细胞中心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)]和炎症因子[白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;采用激光共聚焦检测细胞中钙离子浓度;采用蛋白质印迹法检测细胞中ASK1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,Model组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Bisoprolol组和Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均升高,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Bisoprolol组比较,Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:比索洛尔能够通过抑制炎症反应和钙超载,改善I/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其作用机制可能与抑制ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路激活有关。

p38丝裂原活化蛋白激酶信号调控脂多糖所致程序性死亡配体1表达介导免疫麻痹研究

目的:探讨脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)调控树突状细胞(Dendritic Cell,DCs)免疫共抑制分子程序性死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)表达介导免疫麻痹的机制。方法:以LPS刺激小鼠DCs建立脓毒血症免疫麻痹体系,采用流式细胞术和BrdU细胞增殖实验分别检测LPS所致树突状细胞PD-L1表达和抗原特异性T细胞增殖反应。结果:LPS显著上调DCs免疫共抑制分子PD-L1表达,并抑制DCs介导的T淋巴细胞增殖反应(P<0.0001)。p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)抑制剂——SB203580能显著降低LPS所致PD-L1的高水平表达。SB203580和PD-L1封闭抗体均能显著逆转DCs介导的T淋巴细胞增殖反应的抑制现象(P<0.0001)。结论:LPS上调DCs免疫共抑制分子PD-L1是T细胞免疫反应低下麻痹的主要原因。阻断p38 MAPK信号有助于改善脂多糖所致PD-L1高表达介导的树突状细胞免疫麻痹。

TPPU通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65信号通路对阿尔茨海默病细胞模型的抗神经炎症作用

目的在Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞(BV2细胞)模型中,采用对BV2细胞进行干预,探讨1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)脲(TPPU),TPPU是否具有抗神经炎症作用及其可能的抗炎机制。方法利用Aβ25-35作用BV2细胞构建AD细胞模型,CCK8法分别检测不同浓度Aβ25-35和TPPU处理对BV2细胞活性的影响,最终选择20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为造模组,0.1μM TPPU预处理BV2细胞3h,20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为治疗组进行后续实验。利用ELISA法检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,倒置荧光显微镜检测活性氧(ROS)产生,real-time PCR检测小胶质细胞M1表型促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)基因mRNA表达水平和检测M2表型抗炎因子IL-10及标志物Arg1基因mRNA表达水平。通过Western blot法检测细胞中炎症因子TNF-α蛋白及p38 MAPK/NF-κB p65信号通路相关蛋白表达水平。结果与对照组相比,模型组BV2细胞活力降低(P<0.05),ROS显著升高(P<0.05),MDA含量显著增多(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显上调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显下调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组相比,经TPPU预处理后,BV2细胞活力明显升高(P<0.05),ROS显著降低(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05),SOD活性显著提高(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显下调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显上调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论TPPU抑制Aβ25-35诱导的BV2细胞炎症反应,促进BV2细胞由M1表型向M2表型极化,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB p65信号通路激活有关。