右美托咪定对结肠癌细胞p38MAPK/NF-κB信号通路的影响

目的探讨右美托咪定(Dex)对结肠癌细胞增殖、凋亡及p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法将人结肠癌细胞Caco2随机分为对照组(常规培养)、Dex低剂量组(1μmol/L Dex培养液)、Dex高剂量组(3μmol/L Dex培养液)、激活剂组(5μg/mL p38MAPK/NF-κB信号激活剂LPS)、Dex高剂量+激活剂组(3μmol/L Dex培养液与5μg/mL LPS)。CCK-8法测定Caco2细胞增殖率,流式细胞仪检测Caco2细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹法测定Caco2细胞中增殖相关蛋白(p53、ki-67),凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及p38MAPK/NF-κB通路蛋白的表达情况。结果与对照组相比,Dex低、高剂量组Caco2细胞凋亡率、Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2均显著升高(P<0.05),增殖率、p-p38MAPK、p-NF-κB、p53、ki-67、Bcl-2水平显著降低(P<0.05),激活剂组Caco2凋亡率、Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2均显著降低(P<0.05),增殖率、p-p38MAPK、p-NF-κB、p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)。与Dex高剂量组相比,Dex低剂量组、Dex高剂量+激活剂组Caco2细胞凋亡率、Bax水平及Bax/Bcl-2均显著降低(P<0.05),增殖率、p-p38MAPK、p-NF-κB、p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论Dex可显著抑制人CRC细胞Caco2的增殖,并促进其凋亡,可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。

聚酰胺—胺型树枝状高聚物纳米载体介导的组织因子反义寡脱氧核苷酸防治心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究

目的研究聚酰胺—胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸防治大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制。方法分别设计合成针对大鼠TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF)、正义寡脱氧核苷酸(S/TF)和错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF),分别耦联于PAMAM-D纳米载体,构建ODN-PAMAM-D的聚合物。将100只雄性Lewis大鼠随机等分为假手术组、缺血再灌注组、AS/TF防治组、S/TF对照组和Sc/TF对照组。除假手术组和缺血再灌注组大鼠静脉分别注入生理盐水和PAMAM-D外,其余3组大鼠分别注入与PAMAM-D相耦联的相应寡核苷酸。各组大鼠于注射后10h开胸暴露心脏,除假手术组以外的其他4组大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处结扎造成心肌缺血。心肌缺血90min后,解除结扎,再灌注3h。假手术组的大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处只穿线,不结扎,持续4h 30min。分别于缺血90min和再灌注结束后取各组大鼠的血液检测肌钙蛋白T(TnT)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。并于实验结束后取梗死区及边缘区心肌组织检测TF基因的转录、TF的促凝活性(TF:C)和TF的抗原含量(TF:Ag)以及活性氧簇(ROS)、蛋白酶激活受体-1(PAR-1)和p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)的表达。结果心肌缺血90min及再灌注3h后,缺血再灌注组大鼠血液中的TnT和LDH含量均显著高于假手术组,而AS/TF防治组均明显低于其他3个缺血再灌注组(P<0.05);梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达均强于假手术组,AS/TF防治组则较其他3个缺血再灌注组明显减弱(P<0.01)。流式细胞学检测显示,心肌缺血再灌注3h后,各缺血再灌注组大鼠心肌组织中ROS、PAR-1和p38 MAPK的表达均显著增多,AS/TF防治组则明显低于缺血再灌注组、S/TF对照组和Sc/TF对照组(P<0.05)。结论 TF不仅介导了凝血过程,而且通过激活PAR-1和p38 MAPK诱发了炎性反应,从而加重了心肌组织损伤。TF是心肌缺血再灌注损伤的"中心分子",针对TF的反义寡脱氧核苷酸耦联G10代PAMAM-D纳米载体不仅抑制了TF的转录和表达,而且减轻了心肌缺血再灌注损伤。

低聚原花青素调控TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白质表达保护过度训练大鼠脾脏的作用机制

目的研究低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPCs)调控Toll样受体4 (TLR4)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/核因子-κB (NF-κB)信号通路相关蛋白质表达保护过度训练大鼠脾脏的作用机制。方法雄性Wistar大鼠分为对照组(C组,n=12)、过度训练组(OM组,n=12)、OPCs+过度训练组(OOM组,n=13)。C组不进行任何运动干预,OM组、OOM组大鼠进行6w递增负荷游泳训练。训练期间,OOM组以5 ml/kg (150 mg/kg bw·d)OPCs灌胃,其他组灌胃等体积蒸馏水。末次训练后24 h取材,称重计算脾脏指数,HE染色观察脾脏组织病理学变化,Tunel法检测脾脏组织细胞凋亡水平,免疫组化法检测脾脏p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK (p-p38 MAPK)、NF-κB、B淋巴细胞瘤因子-2 (Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白质表达水平,流式细胞术检测单核细胞表面TLR4表达率,酶联免疫吸附法检测脾脏肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-10 (IL-10)水平,放射免疫法检测血清睾酮(T)和皮质酮(Cor)水平。结果与OM组相比,OOM组大鼠体重、脾脏指数及血清T/Cor比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),脾脏单核细胞表面TLR4表达率显著降低(P<0.05),脾脏p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB蛋白质表达水平及p-p38/p38 MAPK比值均降低(P<0.05),脾脏TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01),脾脏Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05),脾脏细胞凋亡水平降低(P<0.05),组织形态明显改善。结论 6 w递增负荷游泳训练期间补充OPCs可以通过调控TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白质表达,有效缓解过度训练,抑制脾脏炎症因子过度表达及细胞凋亡,保护脾脏。[营养学报,2020,42 (5):479-484]

基于NF-κB/MAPK信号通路miR-125a-5p诱导乳腺癌MCF7细胞自噬的作用机制研究

目的探讨微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)基于核因子-κB(NF-κB)/有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导乳腺癌MCF7细胞自噬的作用机制。方法取对数期生长乳腺癌MCF7细胞,分为miR-125a-5p组、miR-NC组和空白组,采用慢病毒转染法将hsa-miR-125a-5p mimics、NC-mimics分别转染至miR-125a-5p组和miR-NC组,空白组不给予处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染后各组细胞miR-125a-5p基因相对表达水平;采用单丹磺酰二胺及Hoechst双染色检测各组细胞自噬情况,并采用Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)表达情况;采用RT-qPCR、Western blot法检测各组细胞NF-κB/MAPK信号通路相关基因及蛋白相对表达水平。结果空白组、miR-NC组、miR-125a-5p组miR-125a-5p基因相对表达水平分别为0.44±0.08、0.42±0.07、1.27±0.16,miR-125a-5p组miR-125a-5p基因相对表达水平高于空白组和miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);空白组、miR-NC组、miR-125a-5p组细胞阳性率分别为(2.10±0.52)%、(2.30±0.47)%、(26.40±7.14)%,miR-125a-5p组细胞阳性率高于空白组和miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-125a-5p组自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相对表达水平高于空白组和miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组NF-κB p65、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、MAPK p38 mRNA相对表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);miR-125a-5p组NF-κB/MAPK信号通路磷酸化蛋白与相应蛋白比值p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38均高于空白组和miR-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论过表达miR-125a-5p基因可诱导乳腺癌MCF7细胞发生自噬,可能与NF-κB/MAPK信号通路激活有关。

桃叶珊瑚苷通过TGF-β/p38MAPK信号通路调节皮肤损伤修复

目的探讨桃叶珊瑚苷通过转化生长因子-β/p38 有丝分裂原激活蛋白激酶(transforminggrowth factor-beta/P38 mitogen-activated protein kinases, TGF-β/P38MAPK)信号通路促进皮肤损伤修复的作用机制。方法将毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs)按随机数字表法分为空白组、阳性组及10-10、 10-9、 10-8、 10-7、 10-6、 10-5、 10-4、 10-3 mol/L 桃叶珊瑚苷组,相应药物干预 24 h 后,采用 MTT法检测各组细胞增殖率;将 HFSCs 细胞分为空白组,阳性组,桃叶珊瑚苷低、中、高剂量组。阳性组加入 5 mol/L 的碱性成纤维生长因子溶液,桃叶珊瑚苷低、中、高剂量组分别加入 10-7、 10-6、 10-5 mol/L 桃叶珊瑚苷溶液进行干预。采用 Western blot 检测细胞中 TGF-β、磷酸化 P38(p-p38)、 p38、 Bax、 Bcl-2 蛋白表达,采用实时定量 PCR 检测各组细胞中 Bax、 Bcl-2 mRNA 表达。结果与空白组比较, 10-7、 10-6、10-5 mol/L 桃叶珊瑚苷组细胞增殖率[(0.418±0.031)、(0.412±0.014)、(0.468±0.024)比(0.353±0.006)]升高(P<0.01);与空白组比较,桃叶珊瑚苷低、中、高剂量组细胞 TGF-β[(0.377±0.027)、(0.338±0.021)、(0.322±0.017)比(0.557±0.017)]、 p-p38[(0.270±0.020)、(0.228±0.013)、(0.216±0.012)比(0.461±0.012)]、 Bax[(0.450±0.017)、(0.365±0.011)、(0.279±0.006)比(0.551±0.015)]蛋白表达下调,Bcl-2[(0.450±0.017)、(0.365±0.011)、(0.279±0.006)比(0.358±0.011)]蛋白表达升高(P<0.01);Bcl-2mRNA[(1.714±0.028)、(2.514±0.054)、(3.382±0.084)比(1.000±0)]表达升高, Bax mRNA[(0.415±0.020)、(0.353±0.090)、(0.235±0.114)比(1.000±0)]表达下降(P<0.01)。结论桃叶珊瑚苷可通过调节 TGF-β/p38MAPK 信号通路减少下游凋亡因子蛋白及基因的表达,从而促进损伤皮肤修复。

三七茎叶总皂苷抑制七氟醚诱导的海马神经元凋亡机制研究

目的探讨三七茎叶总皂苷(PNSLS)调节七氟醚诱导海马神经元凋亡的作用机制。方法以不同剂量七氟醚(0,4.1%,8%)干预小鼠海马神经元细胞系HT22,使用不同质量浓度的PNSLS(1.5,3.0,6.0,12.0μg/mL)预处理神经元。将HT22细胞分为对照组、暴露于4.1%七氟醚的细胞组(4.1%Sev组)、使用6μg/mL PNSLS对细胞进行预处理1 h后将细胞暴露于4.1%七氟醚组(4.1%Sev+PNSLS组)、在PNSLS处理前1 h加入丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活剂anisomycin(An)再暴露于七氟醚和PNSLS的共培养组(4.1%Sev+PNSLS+An组)。通过CCK-8法检测神经元活力,流式细胞术及免疫印迹(Western blot)法检测海马神经元凋亡,比色活性测定试剂盒测定胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性,Western blot法测定内质网应激相关蛋白及p38 MAPK/核转录因子-κB p65(p38 MAPK/NF-κB p65)信号通路相关蛋白的表达水平。结果4.1%七氟醚显著抑制海马神经元活力(P<0.05),6μg/mL PNSLS显著升高神经元活力并抑制海马神经元凋亡(P<0.05)。与Sev组比较,Sev+PNSLS组细胞中凋亡蛋白Bax表达水平显著降低(P<0.05),B细胞淋巴瘤2家族蛋白(Bcl-2)表达水平显著升高(P<0.05),caspase-3活性显著降低(P<0.05);Sev+PNSLS组内质网应激诱导的凋亡信号通路相关蛋白78000葡糖调节蛋白(GRP78)、内质网应激相关蛋白(CHOP)表达水平均显著降低(P<0.01),p38和IκBα的磷酸化水平均显著降低(P<0.01),细胞质中NF-κB p65水平显著升高(P<0.01),细胞核中NF-κB p65水平显著降低(P<0.01)。与Sev+PNSLS组比较,Sev+PNSLS+An组p38和IκBα的磷酸化水平均显著升高(P<0.01),细胞质中NF-κB p65水平显著降低(P<0.01),细胞核中NF-κB p65水平显著升高(P<0.01),海马神经元活力显著降低(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.01)。结论PNSLS通过激活p38 MAPK/NF-κB p65信号通路抑制七氟醚诱导的神经元凋亡。

天山雪莲愈伤组织提取物对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖及分化的影响

目的研究天山雪莲愈伤组织提取物(extract from callus of Saussureainvolucrate,ESI)对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖及分化的影响,探讨ESI抗骨质疏松的作用及机制。方法以MG-63为研究对象,采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)法检测ESI对成骨细胞增殖的影响,相关试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性和羟脯氨酸(Hyp)水平,茜素红染色法观察对矿化骨结节形成的影响;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测骨保护素(OPG)和核因子-κB活化因子受体配体(RANKL)基因表达水平;Western blotting法检测OPG/RANKL蛋白水平;检测p38特异性抑制剂SB203580对ESI作用于成骨细胞增殖、分化、矿化以及OPG/RANKL表达的影响。结果 ESI低于125μg/mL对成骨细胞无细胞毒性,31.25、62.5μg/mL对成骨细胞生长有促进作用;ESI显著提高ALP活性、Hyp水平以及矿化骨结节形成;显著上调MG-63细胞OPG mR NA水平,下调RANKLmR NA水平,上调OPG/RANKL蛋白水平;SB203580显著抑制ESI对成骨细胞增殖、ALP活性、矿化结节形成的促进作用以及对胶原蛋白积累量和OPG/RANKL值的提高作用。结论 ESI能够促进成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与调节OPG和RANKL基因表达有关,并且可能通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路进行信号转导。