基于PI3K/Akt/p53信号通路探讨白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用

目的通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2型(AML-M2)细胞株Kasumi-1增殖及诱导凋亡的机制。方法利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度。设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24 h后Kasumi-1细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24 h后Kasumi-1细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53信号传导通路蛋白表达情况。结果不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的EAEHDW作用于Kasumi-1细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53信号通路导致p53激活有关。

脂肪干细胞对心肌梗死大鼠心肌组织中miR-423-5p及PI3K/AKT通路的影响

目的探讨脂肪干细胞(ADSCs)对心肌梗死模型大鼠心肌组织中miR-423-5p、PI3K、AKT的影响。方法将实验大鼠随机分为对照组、心梗模型组(模型组)、心梗模型+rADSCs组(干预组),每组6只。对照组大鼠麻醉后仅开胸后缝合,模型组、干预组大鼠麻醉后结扎前降支,干预组在缝合前心脏原位注射大鼠脂肪干细胞(10^(6)个细胞/只)。观测并称量各组大鼠心脏质量,用HE染色及Masson染色观察心肌组织病理变化,实时荧光定量PCR检测miR-423-5p、PI3K、AKT的mRNA表达情况,Western blot方法检测AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。结果与对照组相比,模型组、干预组大鼠的心脏组织质量显著升高,其中模型组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05);病理结果显示模型组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞变性坏死严重,胶原纤维沉淀,可见明显的炎性浸润,干预组的大鼠心肌细胞的坏死情况、炎性浸润、胶原纤维沉淀较模型组明显降低;与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、miR-423-5p的mRNA表达水平和p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);干预组中以上指标的表达水平较模型组显著降低(P<0.05)。结论大鼠脂肪干细胞可以降低心梗模型大鼠心肌组织损伤和纤维化,改善梗死后的心功能。其内在调控机制可能为分泌miR-423-5p,抑制PI3K、AKT的转录水平和蛋白磷酸化水平,发挥保护和治疗心肌梗死的作用。

基于PI3K/AKT通路介导自噬探讨电针颞区治疗血管性痴呆研究

目的 观察电针颞区对血管性痴呆大鼠学习记忆能力、海马CA1区组织形态结构、海马CA1区神经元超微结构及海马组织中PI3K/AKT通路蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT)和自噬相关蛋白(p62、Beclin-1、LC3I、LC3Ⅱ)表达水平的影响,探讨电针颞区通过上调PI3K/AKT信号通路活性抑制神经元过度自噬治疗大鼠血管性痴呆的机制。方法 将SD大鼠分为假手术组、模型组、针刺组和奥拉西坦组,每组各12只。假手术组大鼠进行麻醉后分离颈总动脉,但不结扎。模型组、针刺组和奥拉西坦组采用双侧颈总动脉永久性结扎方法(BCCAO)制备血管性痴呆模型。针刺组选取头针颞区进行电针治疗。假手术组和模型组只做抓取、固定而不治疗。奥拉西坦组给予奥拉西坦溶液灌胃。治疗结束后采用Morris水迷宫实验评估各组大鼠空间学习记忆能力;HE染色观察血管性痴呆大鼠海马CA1区组织形态结构;透射电镜观察血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元超微结构;Western Blot检测大鼠海马组织中蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、p62、Beclin-1、LC3I、LC3Ⅱ)的表达水平。结果 电针和奥拉西坦可缩短大鼠平均逃避潜伏期,增加在目标象限停留时间和穿越平台所在象限次数,改善血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元组织形态及神经元超微结构,降低LC3Ⅱ/LC3I、Beclin-1,增加p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p62,且电针效果优于奥拉西坦,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 电针颞区可能通过上调PI3K/AKT信号通路活性抑制神经元过度自噬的发生改善血管性痴呆大鼠学习和记忆能力。

慢性间歇低氧和复氧对大鼠胰岛素抵抗及骨骼肌miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT表达的影响

目的探讨慢性间歇低氧(CIH)和复氧对大鼠胰岛素抵抗(IR)及骨骼肌miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT表达的影响。方法从基因表达数据库(GEO)中下载CIH条件下miRNA数据集,运用DESeq2筛选差异表达最显著的miRNA作为研究对象,使用miRNA walk网站对差异miRNA的靶基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并Cytoscape软件构建miRNA-mRNA-pathway调控网络。将48只雄性SD大鼠随机分为对照(CON)组和CIH组,24只/组,CON组常氧环境饲养12周,CIH组先予CIH环境饲养8周,再恢复常氧饲养4周。两组均在基线、8周、12周时留取血样和骨骼肌组织,检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,HE染色观察骨骼肌病理改变并计算肌纤维横截面积,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blotting法检测骨骼肌miR-27a-3p、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体1(IRS1)、p-IRS1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸激酶B(AKT)、p-AKT表达,比较组间差异。结果生信分析发现,GEO数据库未筛选出CIH状态下肌肉组织相关的miRNA数据集,仅得到肾脏组织差异表达miRNA的GSE202480数据集,从CON组和CIH组样本中筛选出165个差异表达的miRNA,选最显著miR-27a-3p作为研究对象。GO和KEGG分析显示,差异miRNA的靶基因主要参与肌肉调节和胰岛素信号传导。miRNA-mRNA-pathway调控网络显示miR-27a-3p是PPAR信号通路和PI3K/AKT信号通路的关键调控因子。动物实验发现,基线时,两组各项观察指标均无统计学意义(P>0.05);8周时,与CON组相比,CIH组FBG、FINS、HOMA-IR、PPARγ显著升高(P<0.05或P<0.01),肌纤维排列疏松,肌纤维横截面积、miR-27a-3p、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT显著降低(P<0.05或P<0.01),GLUT4表达呈升高趋势但无统计学意义(P>0.05);12周时,两组各项观察指标均无统计学意义(P>0.05)。结论CIH可导致大鼠IR增加和骨骼肌病理改变,而复氧可以逆转;CIH可致骨骼肌miR-27a-3p表达下调,PPARγ表达上调,IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号转导受到抑制,而复氧干预可以逆转;miR-27a-3p可能通过调控PPARγ/IRS1/PI3K/AKT信号通路参与了CIH所致的IR。

miR-205-5p靶向ERBB3调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制血管生成在痔疮中的分子机制

目的 探讨miR-205-5p靶向ERBB3调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制血管生成在痔疮中的分子机制。方法 收集2021年07月至2022年06月临床12例患者的痔核和正常肛周组织,通过qRT-PCR检测临床病理样本中miR-205-5p和ERBB3的表达情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-205-5p与ERBB3的靶向关系。将miR-205-5p mimic、pcDNA-ERBB3、miR-205-5p inhibitor、sh-ERBB3、oe-ERBB3及阴性对照质粒分别或共同转染至痔疮模型大鼠和HUVEC细胞。HE、TUNEL染色观察组织病理和细胞凋亡情况,免疫组化检测ERBB3、VEGFR2蛋白定位及表达水平,Western blot检测ERBB3、VEGFR2、Cyclin D1、Cleaved-caspase 3、Bax、Bcl-2和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平。MTT、划痕愈合、Transwell实验、流式细胞术、血管形成实验检测各组HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭能力、凋亡率和血管生成量。结果 痔疮临床样本中miR-205-5p呈低表达,ERBB3呈高表达(P <0.001),miR-205-5p与ERBB3(WT)的3'UTR靶向结合(P <0.001)。miR-205-5p mimic组痔疮大鼠和HUVEC细胞中ERBB3表达量显著降低(P <0.01,P <0.001),VEGFR2(P <0.001)、Cyclin D1(P <0.01)、Bcl-2(P <0.001)、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR(P <0.001)水平显著下调,Cleaved-caspase 3和Bax水平显著上调(P <0.01),大鼠肛周组织病理状况改善,HUVEC细胞增殖、迁移和侵袭力均降低(P <0.001),凋亡率升高(P <0.001),血管生成数量及分支减少(P <0.001),pcDNAERBB3逆转了这一效应(P <0.001)。结论 miR-205-5p能通过靶向抑制ERBB3表达,下调PI3K/AKT/mTOR通路活性,抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,减少血管生成,从而缓解痔疮进展。

MiR-140-3p调节PI3K/Akt通路减轻缺氧复氧心肌细胞损伤的实验研究

目的:探讨miR-140-3p靶向调节PI3K/Akt通路对缺氧复氧心肌细胞再灌注损伤的影响。方法:对大鼠来源的H9C2心肌细胞进行缺氧/复氧以诱导细胞损伤,使用miR-140-3p mimics及其对照(NC)转染H9C2心肌细胞,再使用10μmol/L LY294002处理过表达miR-140-3p的H9C2细胞。将心肌细胞分为6组,分别为对照组(CON组)、H/R组(Model组)、Model+NC组、Model+miR-140-3p mimics组、Model+miR-140-3p mimics+LY294002组、Model+LY294002组。采用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各组miR-140-3p相对表达量,CCK-8法检测各组心肌细胞活力,流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率,Western blot检测各组磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspases-3表达量。结果:与CON组比较,Model组miR-140-3p表达量、细胞活力以及Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax、Cleaved-caspases-3蛋白表达和凋亡率明显提高(P<0.05),与Model组比较,miR-140-3p过表达可上调miR-140-3p表达量、细胞活力以及Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白,下调Bax、Cleaved-caspases-3蛋白表达和凋亡率,LY294002可抑制miR-140-3p表达,下调细胞活力以及Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白,上调Bax、Cleaved-caspases-3蛋白表达和凋亡率。结论:MiR-140-3p可通过调节PI3K/Akt通路减轻缺氧复氧心肌细胞自噬和凋亡,进而减轻心肌损伤。

miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/Akt信号通路对高糖诱导视网膜Müller细胞活化及凋亡的影响

目的检测微小RNA-26a-5p(microRNA-26a-5p,miR-26a-5p)对PTEN/PI3K/Akt信号通路及高糖刺激的视网膜Müller细胞凋亡的影响,探讨糖尿病视网膜神经损伤的潜在机制。方法采用不同浓度的葡萄糖刺激视网膜Müller细胞构建糖尿病视网膜神经损伤模型,采用CCK-8及流式细胞仪观察细胞增殖及凋亡情况,细胞转染过表达miR-26a-5p模拟物,Real-time PCR检测miR-26a-5p、PTEN、PI3K、Akt的表达情况,ELISA测定细胞上清液中IL-1β及IL-6的水平,采用Graphpad 8.0软件处理数据。结果高糖刺激视网膜Müller细胞生长活跃,与对照组相比,50 mmol/L高糖刺激Müller细胞活力在12 h、24 h时逐渐增加,48 h时活力减弱,细胞凋亡增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。高糖刺激后视网膜Müller细胞中miR-26a-5p水平下降,PTEN的表达显著升高,PI3K及Akt水平下降,IL-1β及IL-6的水平明显升高,过表达miR-26a-5p后,PTEN水平降低,PI3K/Akt及炎性因子降低,细胞凋亡减少(P<0.01)。结论miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/Akt的表达,影响炎症因子释放,减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡。

lncRNA SNHG12靶向抑制miR-495-3p进而调控PI3K/Akt信号通路对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因12(SNHG12)靶向抑制miR-495-3p/磷脂肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测前列腺癌组织和细胞(LNCaP、C4-2、DU145)中SNHG12、miR-495-3p相对表达水平(将其中的DU145细胞分为si-NC组、si-SNHG12组、si-SNHG12+anti-miR-NC组、si-SNHG12+anti-miR-495-3p组,4组检测);双荧光素酶报告实验检测SNHG12与miR-495-3p靶向关系;MTT法检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白相对表达水平。结果 在前列腺癌组织和细胞(LNCaP、C4-2、DU145)中SNHG12相对表达水平明显升高,miR-495-3p相对表达水平明显降低(P<0.05);敲低SNHG12可降低DU145细胞活性、PCNA、N-cadherin蛋白相对表达水平,减少迁移及侵袭细胞数,增加E-cadherin蛋白相对表达水平(P<0.05);SNHG12可靶向负调控miR-495-3p,下调miR-495-3p可逆转敲低SNHG12对前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。与si-NC组相比,si-SNHG12组p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05);与si-SNHG12+anti-miR-NC组相比,si-SNHG12+anti-miR-495-3p组p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达水平明显增加(P<0.05)。结论 lncRNA SNHG12可能通过靶向抑制miR-495-3p/PI3K/Akt信号通路促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

miR-30e-5p通过靶向PIK3CD介导PI3K/AKT/mTOR信号通路对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的:探讨mi R-30e-5p通过靶向磷酸肌醇-3-激酶催化亚基δ肽(PIK3CD)介导磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制肝癌细胞的侵袭、迁移的机制。方法:将Hep G2通过转染相应质粒后分为对照组、miR-30e-5p mimics组、PIK3CD敲低组、阴性对照组、miR-30e-5p mimics+PIK3CD过表达组,实时荧光定量PCR和免疫印迹检测细胞miR-30e-5p、PIK3CD与PI3K/AKT/mTOR信号通路表达;CCK-8法检测各组细胞增殖率;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测各组细胞迁移、侵袭情况;以免疫印迹实验检测各组细胞基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。采用双荧光素酶报告实验检测miR-30e-5p对PIK3CD的靶向调节。结果:与对照组相比,mi R-30e-5p mimics组、PIK3CD敲低组增殖率、迁移率、侵袭数、PIK3CD蛋白与mRNA表达、N-cadherin、MMP2、MMP9、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、磷酸化m TOR蛋白表达降低(P<0.05),E-cadherin表达升高(P<0.05)。过表达PIK3CD减弱了miR-30e-5p mimics对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,并升高PI3K/AKT/mTOR通过相关蛋白表达。miR-30e-5p可靶向下调PIK3CD表达。结论:上调miR-30e-5p可通过降低PIK3CD表达而阻止PI3K/AKT/mTOR信号激活,从而抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

益肺宣肺降浊方通过EGFR调节PI3K/Akt-MAPK/Erk通路改善血管性痴呆大鼠的记忆

目的 探讨益肺宣肺降浊方通过表皮生长因子受体(Objective Epidermal growth factor receptor, EGFR)调节PI3K/Akt-MAPK/Erk通路改善对血管性痴呆(VaD)的作用及机制。方法 建立大脑中动脉栓塞法(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)大鼠血管性痴呆模型;给予益肺宣肺降浊方联合PTEN、EGFR和MAPK抑制剂,进行行为学实验,并运用Western Blot、免疫荧光、电镜透射等技术检测益肺宣肺降浊方对VaD可能通过PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路作用机制进行探索。结果 益肺宣肺降浊方呈剂量依赖性改善VaD大鼠的记忆能力及脑海马组织的病理、降低神经元凋亡。上调EGFR激活PI3K/Akt信号通路与MAPK/Erk信号通活性。结论 益肺宣肺降浊方对VaD大鼠的作用可能通过VEGF受体EGFR调节PI3K/Akt信号通路与MAPK/Erk信号通活性,以及PI3K/Akt与raf1-MAPK/Erk的串扰作用,增强Erk1/2磷酸化,进而促进神经细胞存活、神经元形态,最终达到修复记忆能力,治疗血管性痴呆的作用。

高良姜素通过PI3K/Akt及p38-MAPK信号通路增强胃癌SGC-7901细胞对阿帕替尼的敏感性

目的探讨高良姜素对阿帕替尼抗胃癌作用的影响及可能机制。方法体外培养胃癌SGC-7901细胞,3-( 4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(M TT)法筛选出高良姜素和阿帕替尼抑制胃癌细胞增殖的合适浓度。将胃癌细胞分为4组:空白对照组、高良姜素组、阿帕替尼组和高良姜素+阿帕替尼组。MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞迁移和侵袭能力;Westernblot检测细胞凋亡及PI3K/Akt及p38-MAPK信号通路相关蛋白表达。结果阿帕替尼和高良姜素均显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖,并呈浓度依赖性(P<0 .05), 20mg/L阿帕替尼和300mg/L高良姜素是最佳的干预浓度。与20mg/L阿帕替尼组相比,高良姜素+阿帕替尼组可以明显抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。流式细胞术结果显示,高良姜素+阿帕替尼组对胃癌SGC-7901细胞促凋亡作用明显优于20mg/L阿帕替尼组(P<0.05)。Westernblot结果显示,高良姜素+阿帕替尼组Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸化蛋白激酶B( p-Akt)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-p38)蛋白表达明显高于20mg/L阿帕替尼组,B淋巴细胞瘤-2( Bcl-2)蛋白明显低于20mg/L阿帕替尼组(P<0 .05)。结论高良姜素可能通过抑制PI3K/Akt和激活p38-MAPK信号通路增强阿帕替尼抗胃癌SGC-7901细胞的作用。

金莲花总黄酮下调miR-215-5p抑制PI3K/AKT信号通路影响AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和迁移

目的 探讨金莲花总黄酮对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖、迁移的影响和潜在机制。方法 不同浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)的金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导CFs。细胞计数试剂盒检测细胞活力确定金莲花总黄酮使用浓度。Transwell实验、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞迁移、miR-215-5p表达水平。Western印迹检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。将miR-215-5p模拟物、抑制物分别转染CFs,检测上调或下调miR-215-5p对AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移的影响。结果 金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导的CFs后,细胞活力、迁移能力、miR-215-5p、磷酸化(p)-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著升高(P<0.05)。下调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达能够显著降低金莲花总黄酮对AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力及PI3K/AKT信号通路的影响(P<0.05)。结论 金莲花总黄酮能够降低AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移,其机制可能与下调miR-215-5p表达和抑制PI3K/AKT信号通路有关。

miR-370-3p通过FOXO1/PI3K/AKT通路抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨微小RNA(miRNA/miR)-370-3p在缺氧/复氧(H/R)H9C2心肌细胞凋亡中的调控作用。方法建立H/R H9C2心肌细胞模型。正常培养的H9C2细胞记为对照组,用miR-370-3p模拟物(miR-370-3p mimic)、miR-370-3p模拟物NC(miR-370-3p mimic NC)不同处理方法处理H/R H9C2心肌细胞。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative fluorescence of reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞中miR-370-3p的表达水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中Caspase-3、FOXO1、PI3K、AKT、p-PI3K的表达水平,流式细胞术检测细胞的凋亡。结果与对照组相比,H/R组心肌细胞中miR-370-3p的表达下降,miR-370-3p的模拟转染明显增加了miR-370-3p的表达水平。H/R明显促进了H9C2心肌细胞的凋亡,转染miR-370-3p模拟物可明显减轻H9C2心肌细胞的凋亡。H/R处理后,凋亡蛋白caspase-3的水平升高,FOXO1的表达明显增加,p-AKT和p-PI3K的表达明显减少。转染miR-370-3p后,caspase-3与FOXO1的表达明显减少,p-AKT和p-PI3K的表达明显增高。结论miR-370-3p可能通过调控FOXO1/PI3K/AKT的表达抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞的凋亡,为改善心肌I/R损伤提供一个新的治疗目标。

麻防犀角地黄汤通过调控microRNA-491-5p影响PI3K/Akt/mTOR通路治疗银屑病的机制

目的 观察麻防犀角地黄汤对银屑病小鼠模型的影响,探讨麻防犀角地黄汤治疗银屑病的作用机制。方法 构建咪喹莫特银屑病小鼠模型,灌胃给药麻防犀角地黄汤,观察模型外观及组织病理学改变,Real time PCR检测皮损组织中microRNA-491-5p、PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达,Western blot检测皮损组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达。结果 麻防犀角地黄汤能改善小鼠皮损、PASI评分、耳廓外缘厚度、组织病理、体质量等指标,上调microRNA-491-5p mRNA的表达,下调PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达量,抑制p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的蛋白表达,并表现出部分量效相关性。结论 麻防犀角地黄汤可能通过调控microRNA-491-5p影响PI3K/Akt/mTOR信号通路在银屑病的治疗中发挥作用。

抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对冈田酸诱导原代星形胶质细胞衰老情况的影响

目的研究冈田酸(OA)诱导的原代星形胶质细胞中通过抑制磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成激酶(GSK)-3β信号通路对p21、p53衰老蛋白表达水平和衰老阳性细胞表达的影响,探讨OA诱导星形胶质细胞衰老情况及相关机制。方法免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞,CCK8法筛选OA药物浓度,然后用LY294002、OA分别处理或联合处理细胞,Western印迹测定细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平的变化及β-半乳糖苷酶染色检测衰老阳性细胞。结果免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞结果显示其纯度达到95%以上,CCK8法筛选出OA药物处理浓度为30 nmol/L,OA组中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达较正常对照组显著升高(P<0.05),衰老阳性细胞数明显增加,但LY294002+OA组p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平较OA组明显降低,并且衰老阳性细胞数也明显减少(P<0.05)。结论通过OA处理能使星形胶质细胞发生衰老,LY294002处理能通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路缓解细胞的衰老情况,提示高磷酸化Tau诱导星形胶质细胞衰老可能与PI3K/AKT/G3K-3β信号通路密切相关。

lncRNA DLEU2/miR-455-3p/OTUD7B轴通过PI3K/AKT信号通路促进宫颈癌恶性发展

目的:探讨长链非编码RNA DLEU2(lncRNA DLEU2,DLEU2)对宫颈癌恶性发展的影响。方法:利用TCGA数据库和qRT-PCR分析DLEU2在宫颈癌组织和细胞系中的表达。采用CCK-8、Western blotting、免疫荧光、细胞划痕、Transwell和TUNEL实验检测干扰DLEU2(sh-DLEU2)对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析DLEU2和miR-455-3p的靶基因,评估miR-455-3p inhibitor/mimic对宫颈癌细胞生长和PI3K/AKT信号通路的影响。裸鼠荷瘤实验检测干扰DLEU2后对瘤体体内生长的影响。结果:宫颈癌组织和细胞系中DLEU2表达显著上调(P<0.01)。sh-DLEU2可抑制Hela和SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.001)。DLEU2与miR-455-3p相结合,OTUD7B为miR-455-3p的靶基因。miR-455-3p inhibitor促进细胞恶性发展并激活PI3K/AKT信号通路,而sh-DLEU2可逆转其作用(P<0.01);miR-455-3p mimic也可部分逆转Oe-OTUD7B对细胞的作用(P<0.01)。此外,sh-DLEU2抑制了裸鼠荷瘤组织的生长(P<0.01)。结论:DLEU2通过miR-455-3p/OTUD7B轴激活PI3K/AKT信号通路促进宫颈癌的恶性发展。

黄芩苷通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR抑制痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞炎症反应机制探究

目的:探究黄芩苷(baicalin)通过微RNA-23a-3p/磷酸酶与紧张素同源物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR)抑制痛风性关节炎(GA)成纤维样滑膜细胞(FLS)炎症反应的机制。方法:提取GA患者和正常人外周血辅助性T淋巴细胞(CD4^(+)T),购买正常人FLS,应用单钠尿酸盐结晶液刺激正常人FLS构建GA-FLS模型,细胞迁移(transwell)进行CD4^(+)T细胞与GA-FLS共培养,构建miR-23a-3p模拟物(miR-23a-3p mimics)转染至GA-FLS中;黄芩苷作用24 h、48 h和72 h后,细胞计数8(CCK8)检测细胞活力并选取最佳作用浓度和时间;实验分为正常组(GA-FLS)、对照组(CD4^(+)T+GA-FLS)、模型组(GA-CD4^(+)T+GA-FLS)、黄芩苷组(GA-CD4^(+)T+GA-FLS+100μg/ml Baicalin)、miR-23a-3p-NC组(GA-CD4^(+)T+GA-FLS+miR-23a-3p-NC)、miR-23a-3p mimics组(GA-CD4^(+)T+GA-FLS+miR-23a-3p mimics)、黄芩苷miR-23a-3p mimics组(GA-CD4^(+)T+GAFLS+miR-23a-3p mimics+100μg/ml Baicalin);实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫印迹(WB)检测miR-23a3p、PTEN、PI3K、AKT、mTOR的表达,酶联免疫吸附(ELISA)测定检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的表达。结果:CCK8检测结果显示黄芩苷最佳作用浓度和时间为100μg/ml、48 h。RT-qPCR和WB检测结果显示:模型组miR-23a-3p mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的表达较正常组、对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);而PTEN mRNA组表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与miRNA-23a-3p-NC组相比,miR-23a-3p mimics组miRNA-23a-3p mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的表达明显上升,PTEN mRNA的表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与miR-23a3p mimics组相比,黄芩苷miR-23a-3p mimics组miRNA-23a-3p mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的表达明显下调,PTEN mRNA的表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)。ELISA检测结果显示:模型组TNF-α、IL1β、IL-6的表达较正常组、对照组明显升高,而IL-10表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与miRNA-23a3p-NC组相比,miRNA-23a-3p mimics组TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显上升,IL-10表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与miR-23a-3p mimics组相比,黄芩苷miR-23a-3p mimics组TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显下调,IL-10表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:黄芩苷可通过下调miR-23a-3p,抑制PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,降低痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞炎症反应。

薄荷脑通过miR-1247-3p/PI3K/Akt通路影响LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应的分子机制研究

目的:探讨薄荷脑对脂多糖(LPS)诱导的Ⅱ型肺泡上皮(AT-Ⅱ)细胞凋亡和炎症反应的影响及分子机制。方法:以5、10、15 mg/L的LPS处理AT-Ⅱ细胞,CCK-8法检测细胞活性;将AT-Ⅱ细胞随机分为对照(NC)组、15 mg/L LPS组、1、5、10µmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组、anti-miR-NC+15 mg/L LPS组、anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS组、miR-NC+10µmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组、miR-1247-3p+10µmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组;采用流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平;Western blot检测蛋白表达;RT-qPCR检测miR-1247-3p表达水平。结果:不同浓度LPS处理后AT-Ⅱ细胞活性降低(P<0.05)。LPS诱导的AT-Ⅱ细胞中Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率升高,TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高,miR-1247-3p表达水平升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低(P<0.05)。不同浓度薄荷脑处理及miR-1247-3p低表达后,Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率降低,TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P<0.05)。miR-1247-3p高表达逆转了薄荷脑对LPS诱导的AT-Ⅱ细胞凋亡、炎症反应及对p-PI3K、p-Akt表达水平的影响。结论:薄荷脑通过miR-1247-3p/PI3K/Akt通路抑制LPS诱导的AT-Ⅱ细胞凋亡和炎症反应。

P38MAPK和PI3K/Akt信号通路在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的交互作用

目的观察p38MAPK和PI3K/Akt信号通路在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的交互作用。方法 Wistar大鼠腹腔单次注射链脲菌素65mg/kg制作糖尿病神经病理痛模型。4周后用vonfrey纤维测双后足机械痛阈,痛阈明显下降为糖尿病神经病理性疼痛造模成功。将96只成模大鼠随机均分为三组:糖尿病神经病理痛组(D组),PI3K抑制药组(E组)和p38MAPK抑制药组(F组)。另取同窝大鼠32只作为对照组(C组)。成模后的每周周一,E组和F组大鼠分别静脉注射PI3K抑制药Wortmannin0.5mg/kg和p38MAPK抑制药SB2035801mg/kg,直至处死大鼠。于给药前(T1)和给药后第2周末(T2)、第4周末(T3)、第6周末(T4)分别随机取8只大鼠,检测机械缩足反应阈值(MWT)、神经传导速度(NCV)、脊髓和背根神经节(DRG)磷酸化Akt(p-Akt)水平和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)水平。结果与C组比较,D、E和F组在T1～T4时MWT下降,NCV减慢,p-Akt和p-p38MAPK水平升高(P<0.05);与D组比较,E和F组在T2～T4时MWT升高,NCV增快,E和F组p-Akt明显下降,F组p-p38MAPK水平明显下降(P<0.05)。结论 P38MAPK通过激活其下游的PI3K/Akt信号通路参与了糖尿病大鼠神经病理痛的形成和维持。

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

目的观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6)NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inosit013-kinase/Akt,PBK/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metalmatrix proteinase-1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91^(phox)、p22^(phox)、p67^(phox)、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP-1、MMP-1蛋白表达。结果 UA能显著抑制瘦素诱导的gp91^(phox)、p22^(phox)、p67p^(phox)、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91^(phox)、p67^(phox)蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论 UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC-T6细胞NOX亚基gp91p^(phox)、p22ph^(phox)、p67p^(phox)、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。