4-羟基芝麻素通过抑制p38MAPK/NLRP3信号通路减轻BV2小胶质细胞神经炎症损伤

4-羟基芝麻素(4-hydroxysesamin)属于双四氢呋喃木脂素类成分,存在于叶下珠、黄荆、香樟等中药中。以芝麻素为代表的双四氢呋喃类成分具有抗肿瘤、抗脑卒中等作用[1-2],但有关4-羟基芝麻素对神经炎症反应的抑制作用及可能机制未见报道。因此,本实验以课题组前期从香樟中获得的4-羟基芝麻素为研究对象[3],采用LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症模型,探讨其对小胶质细胞神经炎症反应是否具有保护作用及可能作用机制,从而为从中药中寻找神经保护类药物提供参考依据。

龙血素B通过P38MAPK信号通路调控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的机制

目的:探究龙血素B对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化和骨形成的影响以及其通过P38MAPK信号通路调控成骨分化和骨形成的机制。方法:培养MC3T3-E1细胞,加入不同浓度(0、15、30、60、90、120μmol/L)龙血素B,采用CCK8法和流式细胞术(FCM)检测不同时间(24h、48h、72h)MC3T3-E1细胞增殖能力和凋亡情况,确定龙血素B促MC3T3-E1细胞成骨最佳的药物浓度及作用时间。培养MC3T3-E1细胞并分为空白组(不作干预),龙血素B组(加入龙血素B共培养),龙血素B+阻断剂组(加入龙血素B和P38抑制剂SB203580共培养),进行干预实验;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组细胞ALP活性,qRT-PCR法检测各组细胞骨桥蛋白(OPN)基因、骨钙素(OCN)基因、骨唾液蛋白(BSP)基因表达水平,茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。结果:龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,效果与浓度和干预时间相关,在90μmol/L浓度下干预48h促MC3T3-E1细胞生长作用最强;干预结束后第1、3、5天,龙血素B组细胞ALP活性较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞ALP活性较龙血素B组降低(P<0.05);龙血素B组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较龙血素B组降低(P<0.05);干预结束后第21天,龙血素B组细胞钙化结节区域面积较空白组增大,龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组减小(P<0.05)。结论:龙血素B可提高MC3T3-E1细胞增殖活性,并通过激活P38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成。

TPPU通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65信号通路对阿尔茨海默病细胞模型的抗神经炎症作用

目的在Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞(BV2细胞)模型中,采用对BV2细胞进行干预,探讨1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)脲(TPPU),TPPU是否具有抗神经炎症作用及其可能的抗炎机制。方法利用Aβ25-35作用BV2细胞构建AD细胞模型,CCK8法分别检测不同浓度Aβ25-35和TPPU处理对BV2细胞活性的影响,最终选择20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为造模组,0.1μM TPPU预处理BV2细胞3h,20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为治疗组进行后续实验。利用ELISA法检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,倒置荧光显微镜检测活性氧(ROS)产生,real-time PCR检测小胶质细胞M1表型促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)基因mRNA表达水平和检测M2表型抗炎因子IL-10及标志物Arg1基因mRNA表达水平。通过Western blot法检测细胞中炎症因子TNF-α蛋白及p38 MAPK/NF-κB p65信号通路相关蛋白表达水平。结果与对照组相比,模型组BV2细胞活力降低(P<0.05),ROS显著升高(P<0.05),MDA含量显著增多(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显上调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显下调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组相比,经TPPU预处理后,BV2细胞活力明显升高(P<0.05),ROS显著降低(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05),SOD活性显著提高(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显下调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显上调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论TPPU抑制Aβ25-35诱导的BV2细胞炎症反应,促进BV2细胞由M1表型向M2表型极化,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB p65信号通路激活有关。

姜黄素通过p38 MAPK/NLRP3抑制肠道病毒71型诱导的细胞焦亡

肠道病毒-A71型(EV-A71)重症感染患儿多表现为过激的炎症反应,病毒感染引起的细胞焦亡可能是机体炎症发生的重要原因之一。本文旨在探究姜黄素对EV-A71病毒感染引起的细胞焦亡与细胞损伤的保护作用及可能的机制。首先,观察了姜黄素对EV-A71引起的细胞毒性的影响。CCK8检测结果显示,EV-A71感染降低细胞的增殖活力;LDH测定表明,病毒增加细胞培养上清中LDH的释放,造成了细胞的损伤;DAPI核染色及Dil细胞膜染色后观察到,EV-A71感染引起了细胞的形态变化和数量减少。姜黄素可以逆转病毒引起的上述变化,提示姜黄素对病毒感染的细胞毒性具有保护作用。细胞焦亡发生时,可促进炎症因子IL-1β的成熟、产生和释放。我们观察了EV-A71及姜黄素干预对细胞IL-1β产生的影响。Western印迹结果显示,病毒感染细胞内IL-1β的活化增加。ELISA检测结果显示,EV-A71病毒感染引起细胞上清中IL-1β的分泌水平增加;qPCR测定结果显示,EV-A71病毒感染细胞中IL-1β的转录水平上调;而姜黄素干预可抑制染毒细胞IL-1β的活化和分泌。Western印迹检测细胞内焦亡相关分子的变化。结果显示,EV-A71感染可诱导细胞发生焦亡,并呈时间和剂量依赖性,分子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、GSDMD、胱天蛋白酶1(caspase-1)参与EV-A71诱导细胞发生的焦亡;姜黄素干预可以有效抑制EV-A71诱导的细胞细胞焦亡。另外,Western印迹检测显示,姜黄素可以减少细胞内EV-A71结构蛋白VP1的水平,通过检测细胞上清中病毒的CCID50发现,姜黄素可以降低细胞上清中病毒的滴度。最后,对姜黄素抗焦亡机制进行了探索,发现EV-A71感染诱导了细胞自噬并激活了p38/NLRP3通路,姜黄素能抑制自噬标志蛋白LC3及自噬底物p62的降解,并抑制p38/NLRP3的激活。总之,本研究明确了姜黄素通过对自噬溶酶体阶段及p38/NLRP3通路的抑制,有效减轻了EV-A71诱导的细胞焦亡,为姜黄素在抗EV-A71感染的临床应用提供参考。

核心岩藻糖基化修饰调控NLRP3介导骨癌性疼痛的作用机制

目的研究核心岩藻糖基化(core fucosylation,CF)修饰对骨癌性疼痛的作用,并探究其作用机制。方法收集我院骨癌性疼痛患者30例,随机选取一半患者使用传统镇痛类药物吗啡治疗,设为吗啡组;另一半患者设为对照组。采用数字疼痛评分法(numerical rating scales,NRS)对所有患者进行疼痛评分;蛋白免疫印迹及ELISA实验观察患者血清及骨髓上清液中NLRP3、IL-1β、IL-18的表达情况;免疫沉淀观察NLRP3及CF修饰的变化。构建乳腺癌致骨癌性疼痛大鼠模型,将40只健康成年SD大鼠分为对照组、模型组、FUT8shRNA组、吗啡组。免疫荧光检测脊髓组织中CF修饰的变化特征;合成腺病毒包装的FUT8shRNA抑制大鼠体内CF修饰后检测脊髓组织中NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18的表达变化;利用VonFrey纤维丝测痛仪测量后爪对VonFrey纤维丝刺激的触觉异常性疼痛敏感性,通过缩爪机械阈值(PWT)和自由行走疼痛评分观察骨癌性疼痛对大鼠疼痛行为的影响,比较两种干预方法对NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt等蛋白表达变化的影响。结果与对照组相比,吗啡组疼痛强度明显降低、持续时间变短(P<0.05);吗啡组血清及骨髓上清液中NLRP3、IL-1β、IL-18表达明显下调(P<0.05);免疫沉淀实验结果显示,吗啡组NLRP3及CF修饰的水平明显下降(P<0.05)。在体内实验中,与对照组相比,模型组大鼠CF修饰表达明显升高(P<0.05);LCA、TNF-α、IL-1β、IL-18的水平显著上升(P<0.01);大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏明显加重(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt表达显著上调(P<0.05);与模型组相比,FUT8shRNA组和吗啡组大鼠CF修饰表达明显降低(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18的水平显著下降(P<0.01);大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏明显缓解(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt表达显著下调(P<0.05)。结论抑制CF修饰可对骨癌性疼痛发挥保护作用,其作用机制可能与调控p38MAPK/PI3K/Akt/NLRP3信号通路有关。

miR-149-3p调控JNK/p38 MAPK信号通路对髓核细胞凋亡、自噬和炎性反应的影响

目的探讨miR-149-3p通过调控JNK/p38 MAPK信号通路对髓核细胞凋亡、自噬和炎症反应的影响。方法体外分离大鼠髓核细胞,用IL-1β浓度为10 ng/ml建立模型组,细胞分为Con组(空白对照)、IL-1β组(IL-1β处理)、IL-1β+miR-NC组(IL-1β处理,转染miR-NC)、IL-1β+miR-149-3p组(IL-1β处理,转染miR-149-3p)、IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin组(IL-1β和通路激活剂Anisomycin处理,转染miR-149-3p)。采用qRT-PCR检测miR-149-3p相对表达水平;MTT、流式细胞术实验检测细胞增殖和凋亡;Western blot检测Bax、Bcl-2、Beclin 1、LC3II/LC3I、JNK/p38 MAPK信号通路相关蛋白表达;ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8表达水平。结果IL-1β组内miR-149-3p相对表达量、细胞活性、Bcl-2蛋白表达明显低于Con组,凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-8表达水平、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达明显高于Con组(P<0.05)。IL-1β+miR-149-3p组内miR-149-3p相对表达量、细胞活性、Bcl-2蛋白表达明显高于IL-1β+miR-NC组(P<0.05),凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-8表达水平、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达明显低于IL-1β+miR-NC组。IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin组的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达、凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-8表达水平明显高于IL-1β+miR-149-3p组,细胞活性、Bcl-2蛋白表达明显低于IL-1β+miR-149-3p组(P<0.05)。结论上调miR-149-3p能促进IL-1β诱导的髓核细胞增殖,抑制细胞凋亡、自噬和炎性反应,其作用机制可能与激活JNK/p38 MAPK信号通路有关。

盐酸巴马汀抑制NF-κB/p38 MAPK信号通路及NLRP3炎症小体抗炎机制研究

目的观察黄连异喹啉生物碱盐酸巴马汀在人急性单核白血病细胞(THP-1)中的抗炎活性,研究其对NF-κB/p38 MAPK信号通路以及NLRP3炎症小体的调控作用机制。方法通过脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞建立初筛模型,ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)水平,初筛黄连中的小檗碱、黄连碱、药根碱、盐酸巴马汀和表小檗碱5种异喹啉生物碱对炎症细胞因子IL-6释放的抑制活性;采用MTT法测定盐酸巴马汀的作用浓度;Western Blot法测定盐酸巴马汀对LPS联合三磷酸腺苷(ATP)刺激THP-1细胞炎症模型中p-IκBα、IκBα、p-IKK、IKK、p-p38、p-38、p-JNK、JNK蛋白表达的影响,同时测定NLRP3、ASC和Caspase-1 p20蛋白的表达,并用Co-IP检测NLRP3炎症小体中pro-caspase-1和ASC的相互作用;ELISA法测定细胞因子IL^-1β和IL^-18的水平。结果与空白对照组比较,模型组IL-6含量升高(P<0.01);与模型组比较,黄连碱组、小檗碱组和盐酸巴马汀组IL-6含量明显降低(P<0.01),由于黄连碱和小檗碱已被大量研究,故选取盐酸巴马汀进行机制研究;盐酸巴马汀在1~60μmol·L^-1浓度范围对THP-1细胞生长没有明显影响(P>0.05),选取1、10、30μmol·L^-1作为盐酸巴马汀低,中,高剂量。与空白对照组比较,模型组p-IκBα、p-IKK、p-p38、p-JNK、NLRP3、Caspase-1 p20蛋白表达明显升高(P<0.01),细胞因子IL^-1β和IL^-18分泌增加(P<0.01);与模型组比较,盐酸巴马汀中剂量组的p-IκBα、p-p38蛋白和盐酸巴马汀高剂量组的p-p38蛋白表达减少(P<0.05),盐酸巴马汀高剂量组p-IκBα、p-JNK、NLRP3和Caspase-1 p20蛋白的表达明显降低(P<0.01),pro-Caspase-1和ASC蛋白的相互作用减弱(P<0.01),细胞因子IL^-1β和IL^-18释放减少(P<0.01)。结论盐酸巴马汀降低THP-1细胞炎症模型中p-IκBα、p-p38、p-JNK、NLRP3和Caspase-1 p20蛋白的表达,干扰pro-caspase-1和ASC的绑定,减少IL^-1β和IL^-18的释放,说明盐酸巴马汀的抗炎作用机制与NF-κB/p38 MAPK信号通路和NLRP3炎症小体信号通路相关。

壮药龙盘止咳方通过调控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路减轻急性支气管炎小鼠肺损伤

目的:探究壮药龙盘止咳方减轻急性支气管炎小鼠肺损伤的潜在机制。方法:KM小鼠采用烟熏法建立急性支气管炎模型,将造模成功的60只小鼠随机分为模型组、SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂,5 mg/kg)组、高剂量(10.4 g/kg)龙盘止咳方组、低剂量(5.2 g/kg)龙盘止咳方组和龙盘止咳方(10.4 g/kg)+SB203580(5 mg/kg)组,每组12只,另将正常饲养的12只小鼠设为对照组。分组完成后进行药物干预,每天1次,连续1周。观察给药前后各组小鼠的一般状态变化;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测BALF中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平;HE染色观察肺组织病理学变化;免疫组化法检测肺组织核因子κB(NF-κB)p65的阳性表达;RT-qPCR检测肺组织核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平;Western blot检测肺组织p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB/NLRP3通路相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,模型组小鼠出现咳嗽、流涕、呼吸急促等症状,且肺部支气管可见炎性细胞浸润、肺泡壁和支气管壁增厚、黏膜充血和水肿等病理损伤,肺组织NF-κB p65在胞核中呈强阳性表达,BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平,肺组织NLRP3、IL-1β、ASC和caspase-1的mRNA表达水平,以及p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3和cleaved caspase-1蛋白水平显著升高(P<0.05),胞质NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,高、低剂量龙盘止咳方组和SB203580组小鼠咳嗽、流涕、呼吸急促等症状,以及肺部支气管炎症细胞浸润等病理损伤明显减轻,肺组织胞核NF-κB p65呈阳性表达的细胞数减少,BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平,肺组织NLRP3、IL-1β、ASC和caspase-1的mRNA表达水平,以及p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3和cleaved caspase-1蛋白水平显著降低(P<0.05),胞质NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05)。且龙盘止咳方和SB203580联合应用对p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路及肺部炎症的抑制作用均优于单独应用。结论:壮药龙盘止咳方可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路的激活,减少肺部炎症细胞因子的产生,从而减轻急性支气管炎小鼠肺损伤。

丹参酮ⅡA介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡

目的:研究丹参酮ⅡA诱导人肝癌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的p38MAPK信号转导通路,揭示其抗肝癌的部分机制.方法:4、8、16mg/L丹参酮ⅡA分别作用人肝癌SMMC-7721细胞48h后,免疫荧光染色观察细胞凋亡情况;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞特征性DNA条带;流式细胞仪法(Flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡和细胞周期;荧光定量PCR检测Fas和Caspase-3基因mRNA的表达水平;并比较阻断p38MAPK信号通路后丹参酮ⅡA对肝癌细胞凋亡和Fas和Caspase-3基因mRNA的表达.结果:丹参酮ⅡA作用48h后,荧光显微镜下观察到经Hoechst染色的典型凋亡细胞.琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞DNA呈规律性的梯状条带.4、8、16mg/L浓度丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞后的细胞凋亡率分别为12.83%±1.51%,17.86%±2.70%和29.24%±7.58%,与对照组6.30%±2.08%比较均有显著性差异(P<0.01);阻断p38MAPK信号通路后,凋亡率和G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.01).8mg/L丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞48h后FasmRNA和Caspase-3mRNA的表达明显上升;阻断p38MAPK信号通路后,丹参酮ⅡA作用人肝癌细胞的FasmRNA和Caspase-3mRNA的表达明显下降.结论:丹参酮ⅡA能诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡,阻滞肝癌细胞于G0/G1期.通过p38MAPK信号转导通路上调Fas、Caspase-3mRNA的表达可能是其诱导肝癌细胞凋亡的重要机制.

P38MAPK和PI3K/Akt信号通路在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的交互作用

目的观察p38MAPK和PI3K/Akt信号通路在大鼠糖尿病神经病理性疼痛中的交互作用。方法 Wistar大鼠腹腔单次注射链脲菌素65mg/kg制作糖尿病神经病理痛模型。4周后用vonfrey纤维测双后足机械痛阈,痛阈明显下降为糖尿病神经病理性疼痛造模成功。将96只成模大鼠随机均分为三组:糖尿病神经病理痛组(D组),PI3K抑制药组(E组)和p38MAPK抑制药组(F组)。另取同窝大鼠32只作为对照组(C组)。成模后的每周周一,E组和F组大鼠分别静脉注射PI3K抑制药Wortmannin0.5mg/kg和p38MAPK抑制药SB2035801mg/kg,直至处死大鼠。于给药前(T1)和给药后第2周末(T2)、第4周末(T3)、第6周末(T4)分别随机取8只大鼠,检测机械缩足反应阈值(MWT)、神经传导速度(NCV)、脊髓和背根神经节(DRG)磷酸化Akt(p-Akt)水平和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)水平。结果与C组比较,D、E和F组在T1～T4时MWT下降,NCV减慢,p-Akt和p-p38MAPK水平升高(P<0.05);与D组比较,E和F组在T2～T4时MWT升高,NCV增快,E和F组p-Akt明显下降,F组p-p38MAPK水平明显下降(P<0.05)。结论 P38MAPK通过激活其下游的PI3K/Akt信号通路参与了糖尿病大鼠神经病理痛的形成和维持。

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

目的观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6)NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inosit013-kinase/Akt,PBK/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metalmatrix proteinase-1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91^(phox)、p22^(phox)、p67^(phox)、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP-1、MMP-1蛋白表达。结果 UA能显著抑制瘦素诱导的gp91^(phox)、p22^(phox)、p67p^(phox)、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91^(phox)、p67^(phox)蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论 UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC-T6细胞NOX亚基gp91p^(phox)、p22ph^(phox)、p67p^(phox)、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。

p38MAPK／14-3-3γ通路在LPS预处理对抗心肌细胞缺氧／复氧损伤中的作用

目的研究p38MAPK/14-3-3γ通路在LPS预处理对抗缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用。方法采用原代培养乳鼠心肌细胞,建立A/R损伤模型及APC、LPS预处理保护模型。实验结束后测定p38MAPK磷酸化蛋白表达及14-3-3γ蛋白表达,同时检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、四唑盐(MTT)比色试验测定细胞存活率、TUNEL法检测细胞凋亡、线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放、流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 LPS预处理对随后心肌A/R损伤有类似APC的保护作用,同时伴随p38MAPK的磷酸化水平升高和14-3-3γ蛋白表达升高;给予SB203850特异性阻断p38MAPK通路,则14-3-3γ蛋白表达明显下调,并且心肌细胞LDH值升高,细胞存活率下降,心肌细胞的凋亡指数升高,mPTP开放加剧,线粒体膜电位降低。结论 LPS预处理对心肌细胞A/R损伤有保护作用,其机制可能是通过激活p38 MAPK,上调14-3-3γ的表达实现。

尿毒清颗粒对糖尿病肾病大鼠肾脏抗炎抗氧化保护作用及对TGF-β_1/p38MAPK信号通路影响的研究

目的探讨尿毒清胶囊对糖尿病肾病大鼠的抗炎、抗氧化作用及对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β_1/p38MAPK信号通路的影响。方法 70只雄性SD大鼠,随机分为10只正常组,60只模型组。模型组大鼠腹腔注射45 mg·kg^(-1)链脲佐菌素(STZ)造模,取造模成功的60只大鼠随机分为12只模型组,12只厄贝沙坦阳性组,12只尿毒清颗粒低剂量组(0.04 mg·kg^(-1)),12只尿毒清颗粒中剂量组(0.08 mg·kg^(-1)),12只尿毒清颗粒高剂量(0.16 mg·kg^(-1)),灌胃给药12周,模型组和空白组给予生理盐水。每周称量体质量,每周检测24 h尿蛋白量。给药治疗12周后,取血检测血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;麻醉处死大鼠,各取8只对肾组织行HE染色,观察肾组织的病理形态;并取肾组织进行RT-PCR和免疫组化观察TGF-β_1/p38MAPK信号转导等转化因子的mRNA及蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠尿蛋白及血清BUN、SCr、TG、MDA含量显著增高(P<0.05),NO、SOD含量显著降低(P<0.01),肾组织胞浆中TGF-β_1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05);通过治疗后,与模型组对比,尿毒清颗粒高剂量组和阳性组肾脏病理损害明显减轻,尿蛋白及血清BUN、SCr、TG、MDA含量显著降低(P<0.05),NO、SOD含量明显增高(P<0.05),肾组织内TGF-β_1、p38MAPK、Caspase-3 m RNA及蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论尿毒清颗粒能降低24 h尿蛋白量,降低TG和MDA含量及升高NO、SOD含量,通过调控TGF-β_1/p38MAPK从而治疗糖尿病肾病的肾组织受损部位,改善肾功能和减轻病理损伤,能有效地保护糖尿病肾病组织。

补肾活血方对人成骨细胞的增殖和分化中p38MAPK及PI3K/Akt信号转导通路的影响

目的通过观察补肾活血方含药血清对人成骨细胞的增殖分化的影响,研究补肾活血方对p38 MAPK和PI3K/Akt信号转导通路的活性相互关联及影响,以探讨补肾活血方临床防治骨质疏松症的作用机制。方法将人成骨细胞株分为空白组(Control组)、补肾活血方含药血清组(Z组)、含药血清+p38 MAPK通路抑制剂SB203580组(SB组),含药血清+PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组(LY组)、含药血清+SB203580+LY294002组(SB+LY组),通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测成骨细胞的增殖情况,生化方法分析检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性,采用Western blot法检测p38 MAPK通路磷酸化p38(p-p38)和PI3K/Akt通路磷酸化AKT(p AKT)的表达水平。结果补肾活血方含药血清能促进成骨细胞的增殖,使成骨细胞的分化增强,与Control组比较差异均有统计学意义(P<0.01);阻断p38 MAPK通路后,对成骨细胞的增殖无明显抑制(P>0.05),而阻断PI3K/Akt通路后细胞增殖下降(P<0.01);两条通路对成骨细胞的分化功能均有显著抑制作用(P<0.01);Western blot结果显示,补肾活血方含药血清能刺激p-p38和p Akt表达,阻断p38 MAPK和PI3K/Akt信号转导通路后,p-p38含量和p Akt明显减少(P<0.01);补肾活血方激活的两条通路之间存在一定的关联性,可互相影响。结论补肾活血方通过PI3K/AKT信号通路调控成骨细胞的增殖,通过同时激活p38 MAPK和PI3K/AKT两条信号通路介导成骨细胞的分化,这可能是补肾活血方临床治疗OP的作用机制之一。

PBX3基因调控p38MAPK信号对肝癌细胞生长及5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的探讨前B细胞白血病同源盒基因(PBX)3基因对肝癌细胞活力、凋亡及5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702为对照细胞,Western印迹法检测肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H和SMMC7721细胞中PBX3的蛋白表达。以LipofectamineTM2000为载体,参照其转染说明将设计合成的PBX3的特异性siRNA(si-PBX3组)及阴性对照siRNA(NC组)转染SMMC7721细胞,仅加入脂质体的为空白对照组,Western印迹检测转染后的细胞PBX3的蛋白表达。SMMC7721细胞分为NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组,细胞处理48 h,噻唑蓝(MTT)及流式细胞术分别检测4组细胞活力和凋亡率。Western印迹检测细胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p-p38MAPK的蛋白表达。结果 PBX3在肝癌细胞中的蛋白表达均显著高于在HL-7702细胞(P<0.05)。与空白对照组相比,si-PBX3组细胞中PBX3蛋白表达显著降低(P<0.05)。与NC组相比,si-PBX3组和5-FU组细胞活力及p-p38MAPK、PCNA蛋白表达水平均显著降低,而细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);si-PBX3+5-FU组细胞活力及PCNA和p-p38MAPK蛋白表达均显著低于si-PBX3组和5-FU组,细胞凋亡率及Bax的蛋白表达均显著高于si-PBX3组和5-FU组(P<0.05)。结论抑制PBX3基因表达可降低肝癌细胞活力,诱导细胞凋亡,增强肝癌5-FU化疗敏感性,机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。

柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白表达的影响

目的:探讨中药柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白表达水平的影响。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,分为空白对照组、柚皮苷10、20、40μmol/L组、塞来昔布80μmol/L组。Western Blot测定培养48h后各组细胞中P38MAPK及ERK1/2蛋白表达水平。结果:Western Blot结果显示,与空白对照组相比,低浓度柚皮苷组(10、20μmol/L)对SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白的表达无明显影响,而40μmol/L柚皮苷及塞来昔布组可明显下调P38MAPK及ERK1/2蛋白表达,具有统计学差异(P<0.05)。结论:柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白的作用,从而可能阻断卵巢癌的发生、发展。

贝母瓜蒌散对慢性阻塞性肺疾病大鼠p38MAPK和MIP-T3表达的影响

目的观察贝母瓜蒌散对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织中p38MAPK信号通路和肿瘤相关因子受体因子MIP-T3的影响。方法将40只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组及贝母瓜蒌散组,每组10只;采用脂多糖(LPS)气管滴入加烟熏法制造COPD大鼠模型,为期30 d。从造模第8天开始,地塞米松组给予地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg),贝母瓜蒌散组给予贝母瓜蒌散灌胃(20 ml/kg),1次/d,连续22 d,模型组予0.9%生理盐水灌胃(20 ml/kg)。Western印迹检测p38MAPK蛋白和MIP-T3蛋白的表达水平。结果与正常组比较,模型组大鼠肺组织p38MAPK和MIP-T3的表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,地塞米松组和贝母瓜蒌散组可降低大鼠肺组织中p38MAPK和MIP-T3的表达(P<0.05);而地塞米松组和贝母瓜萎散组p38MAPK和MIP-T3的表达无明显差异(P>0.05)。结论贝母瓜蒌散有抑制p38MAPK和MIP-T3表达的作用。

p38MAPK通路参与亚急性帕金森病模型小鼠黑质iNOS表达的调控

目的:研究1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致Parkinson病(PD)小鼠模型黑质p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide,iN-OS)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达调控,以探讨PD多巴胺能神经元丢失的可能机制。方法:采用MPTP制备PD小鼠模型,观察行为学变化;采用免疫组化和免疫蛋白印迹法,观察黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、iNOS、caspase-3和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)阳性细胞数和蛋白表达水平变化及给予p38MAPK特异性抑制剂SB203580后对上述变化的影响。结果:模型II组TH阳性神经元明显丢失,小鼠出现典型的PD样行为学表现;模型I组小鼠黑质区p-p38MAPK、iNOS、caspase-3阳性细胞数及蛋白水平显著增加。经SB203580处理后,上述变化明显减轻(P<0.01)。结论:p38MAPK通路对PD模型小鼠黑质区细胞凋亡可能起重要的调控作用,抑制该通路具有一定神经保护作用。

p38 MAPK和STAT3参与CCK-8抑制LPS诱导的大鼠促炎症细胞因子生成

目的:观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)是否改善脂多糖(LPS)引起的大鼠细胞因子的变化,并探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和信号转导子及转录激活子3(STAT3)的信号转导作用,以及CCK受体(CCK-R)的作用。方法:4组大鼠尾静脉分别注入生理盐水(对照)、LPS(8 mg/kg)、CCK-8(40μg/kg)和CCK-8(40μg/kg)+LPS(8 mg/kg),酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清、肺脏及脾脏中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6的变化,Western blotting和免疫荧光双标激光共聚焦显微镜检测肺脏和脾脏磷酸化p38MAPK和磷酸化STAT3的表达,RT-PCR检测脾脏CCK-R亚型的mRNA表达。结果:CCK-8可显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的增加。CCK-8可增加LPS诱导的大鼠肺脏和脾脏磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3的表达。LPS有诱导CCK-AR及CCK-BR mRNA表达量增加的作用。结论:CCK-8对LPS刺激的大鼠促炎症细胞因子过量产生有抑制作用,p38 MAPK和STAT3可能参与了其信号转导机制。LPS刺激时,CCK-R受体发生正向调节,CCK-8有可能用于治疗全身性感染及其它的炎症性疾病。

NOS、p38MAPK、Caspase-3介导大鼠脑缺血神经细胞凋亡可能通路的实验研究

目的探讨脑缺血后细胞凋亡发生的可能机制以及神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated proteinkinase p38．p38MAPK）和半光氨酸蛋白酶-3（caspase-3）在脑缺血后神经细胞凋亡中的共同作用机制。方法采用线栓法闭塞大鼠大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion，MACO）建立脑缺血SD大鼠模型，应用透射电镜观察脑缺血对脑组织超微结构的影响，流式细胞仪方法（FCM）分别定量检测细胞凋亡率，半定量RT—PCR检测nNOS、iNOS，p38MAPK和Caspase-3 mRNA表达水平。结果透视电镜下脑缺血6h出现核固缩，缺血12h出现细胞核分裂，缺血24h出现凋亡小体；FCM检测细胞凋亡百分率随着缺血时间延长而增加，缺血72h达到高峰，约70．37％；RT—PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示nNOS、iNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA的特异性片段大小分别为501、342、250和342bp，但mRNA。表达量不一致，nNOSmRNA主要在缺血早期表达，iNOS，p38MAPK和Caspase-3 mRNA在缺血中晚期表达，并在缺血3～5d，后三种基因的表达量达到高峰。结论脑缺血区域发生典型的神经细胞凋亡现象，nNOS来源的NOS在缺血早期发挥神经毒性作用，INOS来源的NOS在缺血晚期发挥神经毒性作用；NOS，p38MAPK和Caspase-3三种基因的相互关系可能构成介导缺血神经细胞凋亡的通路之一。