新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立

为建立新孢子虫病间接酶联免疫吸附试验(rELISA)检测方法,先诱导表达GST-P43包涵体蛋白,并对其进行提取、纯化、复性处理,再以复性后的P43蛋白作为抗原,优化rELISA检测方法。结果表明,这种包涵体处理方法,可使其纯度达到87%,复性后的目的蛋白具有良好的免疫活性。通过对rELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件,血清稀释倍数为1∶100,抗原包被浓度为7μg/mL,封闭液为0.5%脱脂乳,酶标抗体的工作浓度为1∶4000,酶标抗体作用时间为1 h,底物作用时间25 min。且该方法不与弓形虫和布鲁氏菌病发生交叉反应。

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用。结果酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMP1融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMP1融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用。结论获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用。

proEMAPⅡ/p43蛋白对干扰素诱导蛋白10的调控

目的:研究p43蛋白对干扰素诱导蛋白10(IP10)的调控。方法:用实时定量PCR方法检测p43蛋白作用于HMEC-1细胞后IP10基因水平的变化,并找到p43蛋白作用的最佳浓度范围及最佳作用时间;同时用ELISA方法检测p43蛋白是否促进IP10蛋白的分泌,并检测p43蛋白对可能引起IP10上调的相关因子γ干扰素(IFNγ)、白细胞介素1β(IL1β)及肿瘤坏死因子α(TNFα)的调控作用,试图找到p43蛋白诱导IP10表达上调的原因。结果及结论:p43蛋白能显著上调IP10的表达,并具有一定的量效关系,在p43浓度为70μg/m L、作用时间为6 h时达到峰值;p43蛋白能够诱导IFNγ的分泌,p43蛋白诱导IP10的表达可能是通过上调IFNγ的分泌,并经由JAK-STAT途径实现的。

重组人p43蛋白通过JAK-STAT信号通路抑制新生血管生成

目的探讨p43蛋白抑制新生血管的生成的具体机制。方法将重组人p43蛋白作用于HMEC-1细胞后利用基因芯片进行分析,而后利用qPCR和Western Blot方法检测JAK-STAT信号通路中关键基因表达水平的变化,利用体外管腔形成实验和细胞迁移分析检测重组人p43蛋白抑制新生血管生成活性的变化。结果重组人p43蛋白可以使JAK1、STAT1、IP-10等JAK-STAT信号通路中关键基因表达水平上调,并使JAK1和JAK2的磷酸化水平增强。体外管腔形成和细胞迁移实验结果显示,加入JAK特异性抑制剂AG490阻断JAK-STAT通路后,重组人p43抑制新生血管生成的活性降低。结论重组人p43蛋白通过JAK-STAT通路、诱导IP-10表达,发挥其抑制血管生成的活性。

重组人proEMAP Ⅱ/p43抑制新生血管生成与细胞凋亡关系研究

目的研究p43蛋白抑制新生血管生成是否通过诱导细胞凋亡来实现。方法用不同浓度的p43蛋白(0,10,50,100μg/ml)作用于HUVEC细胞12 h,检测细胞体外管腔形成能力的变化,同时检测细胞周期变化,并通过胞内总半肽天冬酶(caspase)活性检测、caspase3和caspase7基因水平的变化及DNA片段化检测等方法,研究p43蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响。结果与结论 p43蛋白可明显抑制HUVEC细胞体外管腔形成,并随着p43蛋白浓度的升高抑制作用不断增强;不同浓度的p43蛋白对HUVEC细胞周期没有明显影响,不能诱导HUVEC细胞凋亡。p43蛋白抑制新生血管的生成不是通过诱导细胞凋亡来实现的。

地高辛标记探针检测重组人p43蛋白宿主DNA残留量的研究

目的:建立重组人p43蛋白原液中宿主DNA残留量的检测方法。方法:以重组人p43工程菌基因组DNA为模板,制备地高辛标记的探针,并以此探针与阳性对照品及供试品进行杂交及显色反应。结果:3批次重组人p43蛋白原液中每人份剂量的宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:该方法灵敏度高,特异性强,重复性好,操作安全简便,可用于重组人p43制备过程中的原液检定及质量监控。