牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达,使用镍柱进行蛋白纯化,经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小,采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性;将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化,确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证,P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上;Western blotting检测结果显示,P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带,该蛋白特异性和反应原性良好;琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为:抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1280稀释,37℃孵育60 min,二抗稀释度为1∶5000,37℃孵育60 min,邻苯二胺常温显色10 min。结果判定标准为:D 492 nm值>0.3196为阳性;D 492 nm值<0.3101为阴性;0.3101≤D 492 nm值≤0.3196为可疑。敏感性试验结果显示,当阳性样品稀释度为1∶218时,阳性血清判读结果仍为阳性。稳定性试验结果显示,3批次P48蛋白包被的96孔板检测结果的变异系数均<10%;与牛溶血性曼氏海姆杆菌、牛巴氏杆菌阳性血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA抗体检测方法与平板凝集试验阳性血清符合率为100%(18/18),阴性血清符合率为97.5%(39/40)。【结论】本研究建立的牛支原体P48间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,为牛支原体抗体检测及牛支原体疫苗效力检测提供了方法。

基于牛支原体P48蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种准确快速的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗体检测方法,对牛支原体P48蛋白进行原核可溶性表达,采用SDS-PAGE、Western blot对蛋白进行鉴定,将鉴定正确的P48重组蛋白作为抗原,对影响ELISA的各个因素进行方阵优化,建立间接ELISA检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行测试,并进行临床样品检测。结果显示:抗原包被浓度为5μg/mL,4℃包被过夜;10%马血清为最佳封闭液,封闭时间为2 h;一抗最佳稀释度为1∶160,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳稀释度为1∶12 000,孵育时间为30 min;最佳显色时间为20 min。表达纯化的P48蛋白可以与牛支原体血清、乳样发生特异反应,建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,与商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒总体符合率为91.11%。结果表明,本研究建立了一种特异性、敏感性、重复性良好的牛支原体抗体间接ELISA检测方法,为牛支原体病防控及抗体水平检测提供了一种有效方法。

牛支原体武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表达及亚细胞定位

【目的】验证牛支原体P48蛋白在细胞中的位置,并为后续功能的研究奠定基础.【方法】运用Overlap PCR扩增获得点突变后的牛支原体武威分离株P48基因,并将其克隆至pGEM-T Easy,将测序正确的质粒克隆至表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-P48,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并在IPTG诱导下成功获得融合蛋白表达产物rMbP48,大小约为51ku.重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.在分离牛支原体膜蛋白的基础上应用Western-blot及间接ELISA对P48蛋白在细胞中的分布进行分析.【结果】P48蛋白主要存在于牛支原体的膜分离相.全菌免疫荧光试验进一步证实脂蛋白P48位于牛支原体的膜表面.【结论】牛支原体P48蛋白是存在于牛支原体表面的一种具有免疫原性的脂蛋白.本研究为进一步研究P48蛋白的生物学特性及建立高效的牛支原体诊断方法奠定了基础.

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。

内毒素结合蛋白样分子p48体内外生物学活性的初步研究

目的以LBP为对照,对比研究p48的体内、外生物学功能。方法采用生物传感器、流式细胞分析技术研究p48与LPS及Lipid A的结合力。通过体外培养人单核细胞(U937)和小鼠体内TNF-α的分泌实验,研究p48的生物学功能。采用ELISA方法初步探索p48与LBP是否具有一定相似的空间结构。结果p48能促进LPS与PBMC结合,其活性为LBP的81%。p48能与LPS及Lipid A结合,其亲和常数(KD)分别为1.59×10-6、1.48×10-6mol/L。体内外实验中p48均能促进TNF-α的分泌,其生物学活性约为LBP的77%。高浓度抗NH-LBP Fab抗体能与p48特异性结合,p48部分空间结构与LBP可能有一定的相似性。结论p48具有与LBP相近似的生物学功能,在机体炎症反应中也发挥较重要的作用。

牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞增殖和凋亡的研究

试验旨在研究牛支原体P48蛋白对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞增殖和凋亡的影响。收集不同时间段、不同浓度P48蛋白与EBL细胞共孵育的样品,通过MTT法检测细胞增殖率;DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化;流式细胞技术检测该蛋白诱导EBL细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡标志物的mRNA相对表达变化;Western blotting方法检测Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示:当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有极显著的抑制作用(P<0.01),在0.1和0.5μg/mL时对EBL细胞的增殖的抑制作用不显著(P>0.05);经蛋白诱导12 h细胞核形态未有明显变化,24 h细胞核形态发生皱缩和凝聚,48和72 h细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA表达在2和12 h没有明显提高,在24、48、72 h有显著提高,与作用时间呈正相关,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达随之显著提高。流式细胞技术结果显示P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率为48.44%。综上表明,牛支原体P48重组蛋白能够抑制EBL细胞的增殖,促进细胞凋亡,为进一步揭示牛支原体的致病机制提供参考依据。

牛支原体广西分离株P48的原核表达及蛋白纯化研究

为获得牛支原体P48蛋白,以提供免疫学诊断产品及疫苗开发原材料,研究运用PCR方法扩增牛支原体广西分离株的脂蛋白P48的编码基因,构建pET32a-P48重组质粒,导入BL21感受态细胞,在诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导作用下获得P48重组蛋白并进行纯化,然后以纯化蛋白免疫小鼠,借助间接ELISA测定血清抗体效价。结果显示,成功构建了P48重组蛋白表达载体,纯化的P48重组蛋白能刺激小鼠产生良好的免疫反应,三免后血清效价达到6.25×10^(5)。

P48-Triggered transmembrane signaling transduction of human monocytes:mobilization of calcium ion and activation of protein kinase C(PKC)

P48 is a cytokine which induces monocyte differentia-tion and the induction of cytotoxic activity. In this study,the signal transduction events involved in the stimulation of monocytes with the membrane form of P48 (mP48) were investigated. Monocyte stimulation with mP48 was found to involve the mobilization of intracellular calcium (Ca2+)and the activation and translocation of PKC from the cy-tosol to the membrane. Membane P48 induced a rapid rise of intracellular Ca2+ in a dose dependent maner. Simi-larly the stimulation of monocytes with P48 was found to involve the activation and translocation of PKC. The translocation of PKC was rapid (within 0-5 min) yet tran-sient with PKC activity returning to control levels by 8 min. The functional role of protein kineses in P48 induced TNF secretion was studied using various kinese inhibitors. The PKC inhibitors, H-7 and sphingosine, were found to inhibit P48 induced TNF secretion with 50% inhibition at 5μM HA1004, which inhibts cyclic nucleotide-dependent kinase (PKA, Ki 1.2μM), did not inhibit TNF secretion. H-8 (PKA inhibitor) was found to be an effective inhibitor of TNF secretion only at high concentrations(30μp. The Calmodulin-dependent kinase inhibitor, W7 (Ki 12μM)was found to be effective at concentration above 5μM.These findings suggest that P48-triggered TNF secretion involves transmembrane Ca2+ signaling and the subse-quent activation of at least two protein kineses, PKC and CaMK.

9HP48自动变速器动力传递(上)

一、9HP48自动变速器特点ZF 9HP48自动变速器是由ZF制造的9速电子控制单元,已配套多个厂家的多款车型,本文对其动力传递路线作以介绍。ZF 9HP48自动变速器外观如图1所示。1.ZF 9HP48变速器功能特点ZF 9HP48变速器具有下列功能特点：免维护设计;变速器机油不用更换;变矩器利用电子调整锁止控制1~9挡来提供打滑控制功能;

牛支原体新疆分离株P48基因克隆及分子特征分析

本研究旨在分析牛支原体P 48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P 48基因序列(GenBank登录号:CP002188.1)设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P 48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能(信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构)。结果显示,分离株P 48基因序列为1407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P 48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(41.76%),无规则卷曲次之(37.69%)。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P 48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P 48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。

牛支原体P48膜蛋白的原核表达及生物信息学分析

对牛支原体(M.bovis)主要免疫蛋白P48蛋白的保守性和蛋白结构与功能进行分析,为进一步对P48蛋白的免疫特性和致病机制研究奠定基础。本研究通过获取M.bovis Ningxia-1菌株P48蛋白基因序列,构建pET28a-P48质粒并导入大肠杆菌BL21感受态细胞进行原核表达,并通过Ni柱进行重组蛋白纯化、SDS-PAGE电泳和免疫小鼠试验进行验证;利用生物信息学工具分析P48蛋白核酸序列的保守性和蛋白序列的理化性质、二级结构、疏水区、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、抗原表位、三级结构及不同碱基的突变对该蛋白功能的影响。结果表明,通过大肠杆菌原核表达系统可以成功表达重组P48蛋白,并且该蛋白可以激发小鼠产生较高水平的抗体;P48蛋白核酸序列保守,在不同M.bovis菌株中碱基序列无差异;P48蛋白相对分子质量为51159.08,含有468个氨基酸,其中强酸性氨基酸57个,强碱性氨基酸63个,极性氨基酸116个,疏水氨基酸169个,等电点为8.776;1~24位为P48蛋白的信号肽,具有较强的疏水性,并且为跨膜螺旋区;二级结构包含alpha helix、beta sheet、beta turn、random coil 4种形式;抗原表位有13个区域;P48蛋白位于细胞内膜上,是膜脂蛋白家族中ABC转运体的溶质结合蛋白2;该蛋白存在多个突变敏感区域,该区域的改变可能直接影响P48蛋白的功能。本研究的开展为M.bovis P48蛋白的免疫特性和致病机制研究奠定了基础,为M.bovis抗体检测试剂的研制和M.bovis病原的诊断提供了科学的依据。

P48预测乙型肝炎相关性肝癌术后干扰素α辅助治疗的效果

目的研究P48表达与肝癌术后干扰素α(IFNα)辅助治疗效果的关系。方法 1999-2002年间103例肝癌患者根治性切除术后采用IFNα治疗预防复发。用免疫组织化学法检测 P48蛋白在肝癌中的表达情况,分析P48表达与年龄、性别、乙型肝炎病毒标记物、肿瘤直径、包膜、微血管癌栓、肿瘤细胞分化程度等临床病理特征及患者无瘤生存时间和总生存时间的关系。结果肝癌患者P48阳性63例,阴性40例。在P48阳性和阴性的两组患者中,术后第1、3、5年无瘤生存率分别为83．87％、58．12％、44．29％和51．90％、35．50%,、35．50％(x2=5．766,P=0．0163);总生存率分别为92．00％、83．48％、73．95％和92．50％、69．69％、51．04％(x2=5．047,P=0．0247)。两组间的临床特征,包括年龄、性别、HBeAg、甲胎蛋白、硬化结节、肿瘤大小、数目、包膜、Edmondson分级、微血管侵犯等差异均无统计意义。多因素分析表明P48阴性和多发性肿瘤为术后无瘤生存时间和总生存时间的独立危险因素,而HBeAg阳性是总生存时间的独立危险因素。结论P48可预测乙型肝炎相关性肝癌术后干扰素α辅助治疗的疗效。

杆状病毒AcMNPV p48基因在昆虫细胞中的表达

【目的】p48(ac103)基因在昆虫杆状病毒中高度保守,暗示其具有重要的生物学功能。为了研究该基因的功能,我们首先对该基因的表达特征进行描述。【方法】以杆状病毒代表种——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的p48基因为研究对象,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统分别构建了在P48蛋白N-端和C-端融合HA-标签,并且携带绿色荧光蛋白基因和多角体蛋白基因的重组Bacmid。将重组Bacmid转染Sf9细胞,收集含病毒的上清去感染Sf9细胞,在感染后不同时间点收集细胞进行SDS-PAGE电泳,利用商业化的HA抗体进行Western blot分析以检测融合蛋白在昆虫细胞中的表达情况。【结果】用C-端融合HA-标签的重组病毒感染细胞后12h即可检测到一条43kDa左右、能与HA抗体发生特异性结合的蛋白条带,该特异性蛋白的表达一直持续到病毒感染后96h。从感染后48h起一直到96h,均能检测到另外一条约26kDa的蛋白条带也能与HA抗体发生特异性结合。在N-端融合HA-标签的重组病毒感染的细胞中没有检测到与HA抗体特异结合的蛋白。【结论】结果表明,p48基因是个晚期基因,在病毒感染的晚期表达,并且该蛋白在昆虫细胞中表达时N-端可能被剪切。

非结构蛋白P48和P22在诺如病毒感染中的作用

诺如病毒（norovirus， Nov）属于人类杯状病毒科，是引起病毒性腹泻的主要病原之一。诺如病毒非结构蛋白P48可能与高尔基体有相互作用，破坏蛋白质的运输。而非结构蛋白P22能抑制细胞的蛋白分泌。这些研究对了解诺如病毒复制和致病机理奠定基础，同时也为抗病毒的药物开发提供方向。

牛支原体P48蛋白卵黄抗体的制备

为了研究牛支原体P48抗原蛋白的免疫学功能及相应卵黄抗体的生物学特性,探究其抗体效价随免疫时间的变化规律,试验采用牛支原体P48蛋白疫苗免疫健康产蛋母鸡,定时采血并收集鸡蛋,用水稀释法结合硫酸铵盐析法制备特异性卵黄抗体,利用间接ELISA法检测血清抗体(IgG)和卵黄抗体(IgY)效价。结果表明,低、中、高剂量组均能诱导蛋鸡产生有效免疫应答,血清抗体效价与卵黄抗体效价的变化趋势基本一致,但卵黄抗体的产生滞后于血清抗体,在首次免疫后8~10周Ig Y效价达到峰值,其中中剂量组的免疫效价最高,最高效价为1:212。经SDS-PAGE检测,制备所得的纯度达86%以上,得率在8.6 mg/m L以上。说明采用牛支原体P48蛋白免疫蛋鸡可制备高效价、高纯度的抗牛支原体P48蛋白卵黄抗体,从而为卵黄抗体在牛支原体的检测与防控方面的研究奠定了基础。

P48L和D74N突变影响P16基因功能

应用PCR技术，对P16抑癌基因（CDKN2）进行体外定点突变．在P16cDNA中引入第48位密码子CCG（Pro）→CTG（Leu）和第74位密码子GAC（Asp）→AAC（Asn）突变，构建了p16－P48L和p16－D74N突变体，并把它们导入纯合缺失P16基因的人肺癌细胞株H460．经RNA点杂交、Northern印迹、Western印迹和细胞免疫化学染色，检测到P16表达．通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在3H－TdR掺入及细胞所处周期的差异，证实P16表达抑制细胞进入S期，而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有影响．为了确证P48L和D74N突变体丧失抑制细胞增殖的功能是因为与CDK4结合功能下降，将野生型和突变型P16cDNA克隆于酵母表达载体plexA，用酵母双杂交筛选实验研究野生型和突变型p16蛋白与CDK4的结合．结果野生型P16和CDK4在酵母中表达并相互作用．而突变型P16cDNA和CDK4在酵母中相互作用受到影响．说明P48L和D74N突变影响了p16蛋白与CDK4的结合，从而影响了其调控细胞周期的功能．

牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验。重组P48蛋白致敏红细胞的最佳质量浓度是20~40μg/mL,牛支原体超免疫血清抗体效价达1∶2 048~1∶4 096。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清的检测结果均为阴性。该方法的特异性为100%,敏感性为93.33%。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。