猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从MhpJ株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和westernblot检测重组蛋白表达及其免疫学活性。以该重组蛋白为抗原免疫兔制备抗血清,采用间接ELISA检测抗血清效价,并利用抗血清通过间接免疫荧光检测P52基因在AD-293细胞中的表达情况。结果表明,PCR扩增目的基因为1202bp,SDS-PAGE检测重组蛋白大小约52ku,其表达量占菌体总蛋白的28%。Westernblot检测表明,目的蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫活性。间接免疫荧光检测到P52基因在AD-293细胞中表达。本研究为构建P52蛋白腺病毒载体疫苗奠定了基础。

弥漫性大B细胞性淋巴瘤中EB病毒与p100/p52蛋白的表达及意义

目的检测弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)中EB病毒与p100/p52蛋白的表达,进一步了解EBV阳性的DLBCL发病机制及临床病理意义,探讨DLBCL中EBV与p100/p52蛋白表达的相关性。方法应用原位杂交检测EBV编码mRNA(EBER-1)的表达;运用免疫组化方法检测LMP1及p100/p52蛋白的表达。结果 190例DLBCL中EBV(+)24例(12.6%),发病年龄>40岁,平均70.04岁。其中,汉族发病高峰年龄>70岁,维族>60岁,汉族患者发病年龄略高于维族。DLBCL中EBV阳性与阴性组进行对比,IPI和LDH差异显著(P<0.05)。24例EBV(+)中22例p100/p52蛋白(+),p100/p52蛋白与EB病毒之间存在明显相关性(P<0.05)。结论 p100/p52蛋白在EBV阳性DLBCL中高表达,参与DLBCL的发生、发展并促进肿瘤的生长;因存在相关性,则抑制剂可作为选择性治疗方式。NF-κB过表达是不良的预后标记,p100/p52也许能用于预测预后并在治疗性干预措施中成为一个潜在靶点。

猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

rhLEDGF p52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

目的构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,获得rhLEDGFp52蛋白。方法利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对rhLEDGFp52进行鉴定并用Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化。结果成功构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%.WesternBlot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,最终质量浓度达520mg·L-1,分析其纯度达87.93%.结论成功获得rhLEDGFp52蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。

siRNA-LEDGFp52真核表达载体的构建和鉴定

目的构建晶状体来源的上皮生长因子p52(lens epithelium derived growth factor p52,LEDGFp52)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)的真核细胞表达载体。方法以LEDGFp52为靶基因,以pGensil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的LEDGFp52基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGensil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功,重组质粒转染HeLa细胞48h,Western blotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变。结论利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体。

rhLEDGF p52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化(英文)

目的 :构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体 , 获得rhLEDGF p52 蛋白。方法:利用基因重组技术将 rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体 pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过 IPTG 诱导在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对 rhLEDGF p52 进行鉴定并用 Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化。结果:成功构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体,在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的 34.63%。Western Blot 结果显示 rhLEDGF2 蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化后的 rhLEDGF p52,终浓度达 520mg/L,分析其纯度达 87.93%。结论:获得 rhLEDGF p52 蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。

结肠癌组织P52的表达和临床意义

目的:探讨核转录因子-κB2(P52)在结肠癌中的表达及临床意义。方法:应用SP免疫组化法检测70例结肠癌组织和35例癌旁组织P52的表达情况,并分析P52表达与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌组织P52的阳性表达率为70.0%(49/70),明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。结肠癌组织P52表达与年龄、性别、分化级别无关(P>0.05);与侵及深度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05):侵及浆膜明显高于未侵及浆膜,TNM分期Ⅲ+Ⅵ期明显高于Ⅰ+Ⅱ期,有淋巴结转移明显高于无淋巴结转移。结论:P52高表达可能与结肠癌的浸润、转移和预后有关。

人剪切修复基因XPD对p52和p21基因的影响

目的:探讨人剪切修复基因XPD转染人HepG2肝癌细胞后p52和p21基因表达的变化以及对肝癌细胞生长的影响。方法:人肝癌细胞HepG2为靶细胞,XPD基因通过Lipofectamine2000脂质体转染HepG2。将细胞分为重组质粒HepG2-pEGFP-N2-XPD组(XPD组)、空载质粒HepG2-pEGFP-N2组(N2组)和HepG2空白对照组。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Westernblot)法检测各组细胞中XPD、p52以及p21的mRNA和蛋白质的表达量,并用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测各组细胞的增殖能力。结果:XPD组中的p52的mRNA表达较其他2组显著下调,XPD、p21的mRNA表达较其他2组明显上调(均P<0.01)。Westernblot检测结果显示各组细胞中XPD、p52及p21的蛋白表达各组间差异与其mRNA各组间差异一致。MTT检测显示XPD转染入HepG2后细胞增殖能力减弱。结论:XPD基因可以抑制癌细胞的生长和基因p52的表达,促进p21的表达。

早期蛋白p52对人巨细胞病毒基因复制作用的实验研究

目的 :探讨HCMVDNA聚合酶辅助蛋白p5 2在病毒基因复制过程中的作用。方法 :采用体外实验方法建立HCMV感染细胞模型 ,在感染后不同时间段 ,FQ PCR法测定细胞内HCMVDNA拷贝数 ,免疫组化法检测病毒蛋白p5 2 ,计算机图像分析系统处理结果。同时光镜观察致细胞病变作用 ,电镜检查其超微结构的改变。结果 :感染后各组细胞内均能检测到HCMVDNA及p5 2表达 ,随感染时间延长 ,二者水平均升高 ,p5 2定位于感染细胞核内。与感染后 12h相比 ,此后各时段p5 2表达量均明显增高 (P <0 0 1) ;而至感染后 48h ,细胞内HCMVDNA量方明显高于感染后 12h(P <0 0 5 ) ,持续到感染晚期 ;同时细胞开始出现病变 ,并随感染时间延长、细胞内p5 2表达水平升高及HCMVDNA量增多而逐渐加重。结论 :早期蛋白p5 2在HCMVDNA复制过程中发挥重要作用 ,可有效促进病毒基因复制。

基于NIK/IKKα/p52通路探讨雷公藤多苷对IgA肾病大鼠的肾脏保护作用机制

目的:观察雷公藤多苷对IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)大鼠的肾脏保护作用,并基于核因子κB诱导激酶(nuclear factor kappa B inducing kinase,NIK)/核因子κB抑制物激酶α(nuclear factor kappa B-inducing kinaseα,IKKα)/核转录因子-κB2(nuclear transcription factor-κB2,p52)信号通路探讨作用机制。方法:将42只SD大鼠随机分为空白组10只和造模组32只。造模组大鼠采用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)灌胃、四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl 4)皮下注射联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)尾静脉注射的方法建立IgAN模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、泼尼松组(6.25 mg·kg^(-1))和雷公藤多苷组(9.375 mg·kg^(-1))。各药物组大鼠按照相应剂量灌胃,空白组和模型组大鼠给予生理盐水,每日1次,连续7周。采用全自动生化分析仪检测尿液24 h尿蛋白定量(24 hours urinary total protein,24 h-UTP)、尿红细胞(urinary red blood cell,URBC)、血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。采用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量,HE染色观察肾脏病理学形态,免疫荧光染色观察肾小球系膜区免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)表达水平,Western blot和RT-PCR法检测肾脏NIK、IKKα、P52蛋白和基因表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠24 h-UTP、URBC、Scr、BUN、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05),血清ALB水平降低(P<0.05);与模型组比较,泼尼松组、雷公藤多苷组大鼠24 h-UTP、URBC、BUN、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),ALB水平升高(P<0.05)。HE染色显示,空白组大鼠肾脏结构无异常;模型组大鼠肾小球系膜细胞增生,肾小管上皮细胞水样变性,伴炎症细胞浸润;泼尼松组、雷公藤多苷组大鼠的上述病理表现较模型组明显减轻。免疫荧光染色显示,空白组大鼠肾小球系膜区未见IgA沉积;模型组大鼠肾小球系膜区显示较多IgA沉积,泼尼松组、雷公藤多苷组大鼠IgA沉积较之明显减少。与空白组比较,模型组大鼠肾脏NIK、IKKα、p52蛋白和基因表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,泼尼松组、雷公藤多苷组大鼠肾脏NIK、IKKα、p52蛋白和基因表达水平降低(P<0.05)。结论:雷公藤多苷可能通过调节NIK/IKKα/p52信号通路,减轻IgAN大鼠的肾小球损伤和炎症反应,从而发挥肾脏保护作用。

Capn4和P52在结肠癌中的表达及意义

目的:探讨钙蛋白酶小亚基-1(Capn4)和核转录因子-κB2(p52)在结肠癌中的表达及临床意义,以及两者在结肠癌发生、发展过程中的相关性。方法:应用免疫组织化学方法检测70例结肠癌组织及35例癌旁正常结肠组织中Capn 4和p52的表达情况,并分析Capn 4和p52的表达与结肠癌临床病理特征的关系。结果:Capn 4及p52在结肠癌(74.3%、70.0%)中的表达明显高于癌旁正常结肠组织(22.9%、31.4%)(P<0.05),两者在结肠癌组织中表达与结肠癌的浸润深度、TNM分期以及有无淋巴结转移密切相关(P<0.05),与患者年龄、性别、分化程度无关(P>0.05),并且两者在结肠癌的发生发展中可能存在相关性(r=0.869,P<0.05)。结论:Capn 4和p52在结肠癌组织中高表达,提示两者可能与结肠癌的浸润、转移有关。两者的表达呈正相关,提示Capn 4可能通过NF-κB通路的非经典途径起作用。

p52在结肠癌细胞对奥沙利铂耐药中的作用

目的观察p52在结肠癌细胞对奥沙利铂耐药中的作用。方法复苏结肠癌SW480、LoVo细胞、奥沙利铂处理细胞24 h，Western blot法检测SW480细胞中p52蛋白表达以研究奥沙利铂对p52蛋白的作用。采用大剂量冲击法诱导结肠癌耐奥沙利铂细胞，细胞计数试剂盒（CCK-8）实验检测其耐药性。Western blot检测原代耐药细胞p52表达，染色质免疫共沉淀（CHIP）实验检测p52能否转录调控B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）。沉默耐药细胞中p52后，Western blot检测细胞内p52和bcl-2表达，膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin V/PI）染色、流式细胞术检测Annexin V（＋）/PI（＋）细胞的比例。SPSS 23.0统计软件进行统计分析。结果奥沙利铂上调结肠癌细胞中p52表达（t＝20.730，P＝0.002），p52蛋白在结肠癌耐奥沙利铂细胞中明显升高（t＝4.029，P＝0.006），差异均有统计学意义。CHIP实验结果显示p52蛋白结合到bcl-2基因启动子区域，转录调控bcl-2基因。沉默耐药细胞中p52后，bcl-2蛋白表达下调22.6%（t＝18.183，P＝0.003），流式细胞术提示实验组凋亡细胞比例为23.5%，比对照组升高了2.96倍（t＝6.783，P＝0.021）。 结论 p52通过通过上调bcl-2基因抑制细胞凋亡促使结肠癌细胞对奥沙利铂耐药。

人p52Shc1蛋白的真核表达及其活性鉴定

[目的]构建带his标签的人p52Shc1基因真核表达载体,并根据其生物学活性进行鉴定。[方法]采用PCR技术以Shc1 cDNA基因为模板扩增Shc1基因,将其插入pEnter载体构建pEnter-p52shc1重组质粒,将重组质粒与空载体分别转入293T细胞,利用Western Blot检测p52Shc1表达情况,并使用cck-8法绘制细胞生长曲线。[结果]通过双酶切获得2条与目的基因大小相符的片段,测序结果显示符合率为100%,Western Blot结果显示在52 kDa大小处出现清晰单一条带,cck-8法绘制的细胞生长曲线显示,转染重组质粒pEnter-p52Shc1的细胞生长速率明显大于转染pEnter空载的细胞(P<0.01)。[结论]成功构建带his标签的人p52Shc1基因真核表达载体并在293T细胞中成功表达,转染重组质粒并表达p52Shc1蛋白的293T细胞的增值速率明显提高。

非传统性NF-κB信号转导通路与血液系统疾患

核因子κB(NF-κB)包括RelA,RelB,c-Rel,NF-κB1和NF-κB2,在免疫反应、炎症反应、肿瘤形成、外周淋巴器官发育和淋巴细胞发育等多种生物学过程中起重要作用。NF-κB活化通路有两条:传统途径(经典途径)和非传统途径(选择性途径)。以往对于恶性血液系统疾患的研究都集中在传统性NF-κB活性(p50-RelA为主)上,近年来非传统性NF-κB信号转导通路在肿瘤尤其是B细胞源性恶性肿瘤中的作用也逐渐引起重视。了解非传统性NF-κB信号转导通路的生物学功能及其与血液系统疾患的关系,为血液病的治疗寻求一种新的途径。本文就非传统性NF-κB信号转导通路及其与恶性血液系统肿瘤的关系进行了综述。

电针对局灶脑缺血/再灌注大鼠海马内NF-κB旁路途经的调节作用

目的:观察局灶脑缺血/再灌注后不同阶段大鼠海马内IKKα及NF-κBp52的表达及电针对NF-κB旁路途径的调节作用。方法:SD健康雄性大鼠(280-300g)108只随机分为假手术组(n=12),电针组(n=48)及模型组(n=48),按照再灌注后24h与7d将电针组及模型组分为2个亚组。采用右侧大脑中动脉闭塞/再通线栓法建立局灶脑缺血/再灌注模型。电针组取"合谷"穴、"太冲"穴,选用G6805-1型针灸治疗仪进行电针治疗。用FJB染色观察脑缺血/再灌注后海马区内神经细胞的损伤情况;利用免疫组化、Western blot检测不同时间点海马区内IKKα的蛋白表达及NF-κB p52胞核内的蛋白表达变化。结果:FJB染色显示局灶脑缺血/再灌注后,海马区内神经细胞变性损伤明显(P<0.05);与模型组比较,电针干预后海马区内神经细胞变性损伤减少(P<0.05)。免疫组化及Western blot显示模型组大鼠海马内IKKα表达于再灌注后24h及7d均显著升高(P<0.05);胞核内NF-κB p52的蛋白表达随IKKα表达增加而增加(P<0.05)。电针组与模型组比较,海马内IKKα蛋白表达及胞核内p52的蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论:脑缺血/再灌注刺激能诱发海马区内IKKα表达升高,活化p52入核激活信号通路造成海马区内神经细胞的损害;电针干预后能明显抑制IKKα的表达,阻止其活化p52进而有效缓解缺血/再灌注后海马内神经细胞的损伤。

bcl-2与p53基因在口腔白斑及口腔鳞癌中表达的意义

目的 :研究 p5 3和 bcl-2的基因产物在正常口腔粘膜 (NOM)、口腔粘膜白斑 (OLK)及口腔鳞癌 (OSCC)中的表达及意义。方法 :应用免疫组织化学 S-P法 ,对 NOM(1 0例 )、OLK(1 7例 )、OSCC(3 2例 )中 p5 3和 bcl-2的表达情况进行测定。结果 :p5 3在正常 NOM中无表达 ,在 OLK中有中度表达 (阳性率 2 9.4% ) ,在 OSCC中有较强的表达 (阳性率 5 6.2 5 % ) ;bcl-2在 NOM中无表达 ,在 OLK中有较强的表达 (阳性率 2 3 .5 3 % ) ,而在 OSCC中的表达 (阳性率 2 1 .88% )与 OLK中的表达比较差异无显著性。结论 :1 p5 3的突变和 bcl-2的过度表达 ,通过抑制细胞凋亡促进了OLK和 OSCC的形成 ;2在 OLK的形成过程中 ,突变型 p5 3和 bcl-2的基因产物表达呈正相关 ,而在 OSCC的形成过程中 ,二者的基因产物无明显相关性 ;3 bcl-2在 OLK和 OSCC的形成过程中 ,并非单纯通过抑制细胞凋亡这一机制而起作用 ;4突变型 p5 3的表达可作为 OLK及 OSCC的基因标志物。

辛开苦降法对脾胃湿热证小鼠炎症因子和免疫功能的影响

目的观察连朴饮对小鼠脾胃湿热证的炎症因子与凋亡基因、抑癌基因蛋白表达的调节作用,探讨辛开苦降法对脾胃湿热证免疫功能的影响。方法采用内因湿热法即高脂高糖饮食复制脾胃湿热证动物模型。SPF级昆明小鼠,雌雄各半随机分成6组,即正常组,模型组,黄芩滑石汤组,连朴饮低、中、高剂量组(6.2、12.4、24.8 g/kg),每组10只。用ELISA法检测干扰素-γ(interferen-gamma,IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)的含量;用HE染色法观察胃肠组织形态学的变化;用蛋白质印迹法检测Bcl-2、p53的蛋白表达水平。结果与正常组相比,模型组小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4值明显升高(P<0.05)。与模型组比较,连朴饮各剂量组均显著降低小鼠血清中上述指标的含量(P<0.05)。高剂量组的指标降低最明显,其次是中剂量组,低剂量组的指标降低的较少。结论连朴饮能降低IFN-γ、IL-4值,抑制Bcl-2、p53蛋白的表达,其发挥作用的机制可能是降低机体的炎症反应,改善免疫状态,恢复免疫平衡。

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P<0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。