猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

早期蛋白p52对人巨细胞病毒基因复制作用的实验研究

目的 :探讨HCMVDNA聚合酶辅助蛋白p5 2在病毒基因复制过程中的作用。方法 :采用体外实验方法建立HCMV感染细胞模型 ,在感染后不同时间段 ,FQ PCR法测定细胞内HCMVDNA拷贝数 ,免疫组化法检测病毒蛋白p5 2 ,计算机图像分析系统处理结果。同时光镜观察致细胞病变作用 ,电镜检查其超微结构的改变。结果 :感染后各组细胞内均能检测到HCMVDNA及p5 2表达 ,随感染时间延长 ,二者水平均升高 ,p5 2定位于感染细胞核内。与感染后 12h相比 ,此后各时段p5 2表达量均明显增高 (P <0 0 1) ;而至感染后 48h ,细胞内HCMVDNA量方明显高于感染后 12h(P <0 0 5 ) ,持续到感染晚期 ;同时细胞开始出现病变 ,并随感染时间延长、细胞内p5 2表达水平升高及HCMVDNA量增多而逐渐加重。结论 :早期蛋白p5 2在HCMVDNA复制过程中发挥重要作用 ,可有效促进病毒基因复制。

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P<0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。

人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响

目的 探讨人巨细胞病毒 (HCMV)主要基因序列表达情况对其感染结局的影响。方法采用不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞 ,建立HCMV梯度感染细胞模型。分别应用FQ PCR法测定感染细胞内IE基因拷贝数、免疫组化法联合计算机病理图文分析系统检测p5 2蛋白表达水平以及RT PCR法测定MCPmRNA转录水平 ,光镜观察致细胞病变作用 (CPE)、电镜检查细胞超微结构改变。结果 IE基因在病毒滴度最低的A组细胞内负荷量最低 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ;p5 2蛋白在病毒滴度较高的B、C组表达水平明显高于A组 (P <0 .0 1) ,其表达定位于受染细胞核内 ;仅在B、C组内检测到MCPmRNA。A组未检出细胞病变 ,B、C组细胞检测到随感染时间延长而加重的CPE及超微结构改变。结论 HCMV受染细胞内IE基因负荷量与病毒基因组表达启动密切相关 ,p5 2蛋白高效表达是病毒基因组完整表达的必要条件 ,MCPmRNA转录是活动性HCMV感染的标志。