人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路的活化及抑制对皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞增殖、凋亡情况的影响,探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制。方法培养人A431皮肤SCC细胞株,分为低、中、高浓度的MAPK/ERK通路抑制剂(PD98059+DMSO)组及激活剂(IGF+PBS)组、空白对照(DMSO)组。噻唑蓝法检测细胞体外增殖活力,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡,Western blot检测各组A431细胞中P-ERK、P53蛋白表达。结果经不同浓度的抑制术PD98059处理A431细胞,细胞增殖受到抑制,呈浓度-效应和时间-效应关系(P<0.05);经不同浓度的激动剂胰岛素样生长因子(IGF)处理A431细胞,细胞增殖受到促进,呈浓度-效应和时间-效应关系(P<0.05)。FCM检测结果显示,PD98059作用于A431细胞,细胞凋亡率明显增高,呈浓度-效应关系(P<0.05);而IGF作用于A431细胞,细胞凋亡率明显降低,呈浓度-效应关系(P<0.05)。Western blot检测结果显示,PD98059处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达降低,P53蛋白的表达增强,随着PD98059浓度的增加,P-ERK蛋白明显降低,P53蛋白明显增强(P<0.05);而IGF处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达增强,P53蛋白的表达降低,随着IGF浓度的增加,P-ERK蛋白明显增强,P53蛋白明显降低(P<0.05);经过Pearson相关性分析,P53与P-ERK的表达呈负相关(P<0.05)。结论人A431细胞中MAPK/ERK信号通路被IGF激活后,促凋亡因子P53表达降低,细胞增殖能力增强,凋亡能力降低;而该通路受抑制后,促凋亡因子P53表达增高,细胞增殖能力降低、凋亡能力增强。

腺苷酸活化蛋白激酶信号通路变化与老年高脂患者关系的研究进展

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是参与细胞生物调节及代谢的一种关键酶。早期研究发现AMPK可以磷酸化胆固醇合成通路中的限速酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA），导致胆固醇合成减缓；并磷酸化脂肪合成中的主要酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC），最终导致脂肪酸合成减缓。

腺苷酸激活蛋白激酶AMPK与肿瘤的关系研究进展

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是维持细胞能量稳态的重要介质。激活AMPK可促进ATP的产生和调节代谢以应对能源短缺。AMPK是治疗代谢综合征和2型糖尿病的已知靶点,近年来,AMPK作为一种可能的肿瘤防治靶点逐渐出现。本文主要通过采用文献检索、综合分析的方法总结在肿瘤或耐药肿瘤细胞中AMPK的作用、相关信号通路、相关药物、产生的效应,为AMPK在肿瘤细胞中的研究奠定基础。

葛根素通过AMPK/mTOR通路激活自噬治疗小鼠高脂血症

本研究旨在探讨葛根素(Puerarin, PUE)对高脂血症(Hyperlipidemia, HLP)模型小鼠治疗效果的机制.实验选用C57BL/6J品种小鼠,随机分为空白组(Control)、模型组(Model)以及葛根素低、中、高剂量治疗组(PUE-L、PUE-M、PUE-H).成功构建高脂血症模型后,对小鼠进行了为期4周的葛根素干预治疗,并采用试剂盒检测了小鼠血脂谱的变化情况.此外,观察小鼠肝脏组织的病理变化,并通过Western blot方法对肝脏组织中的关键蛋白进行了检测,包括腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)与雷帕霉素哺乳动物靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白、脂质代谢的关键调控蛋白固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、以及自噬过程中的微管相关蛋白轻链3(LC3)和自噬底物(P62)的表达水平.进一步使用了定量聚合酶链反应(q-PCR)技术,来检测肝组织中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA转录水平,以及AMPK/mTOR信号通路相关的mRNA和炎症因子的mRNA的转录水平.相较于模型组,葛根素处理组小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平明显下降,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平则显著上升.肝脏组织中,细胞空泡样变化及脂滴积聚在葛根素干预后明显减少.在给药后,肝组织中的ACC、FAS、SREBP-1c mRNA的相对表达量有所降低,脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)和促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)的表达下降,而抗炎因子白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)和白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的表达水平则有所上升.此外,小鼠肝脏组织中的mTOR、SREBP、P62蛋白水平降低,而AMPK、p-AMPK、LC3蛋白的表达水平则增加.综上所述,实验结果表明,葛根素能够有效改善高脂血症模型小鼠的血脂谱,并降低炎症反应.其作用机制可能与葛根素调节AMPK/mTOR信号通路,促进自噬过程的激活有关.这些发现为高脂血症的治疗提供了新的视角,特别是在利用植物药物治疗的方面.

根皮素调控有氧糖酵解激活AMPK-P53信号通路抑制结肠癌细胞生长

目的探讨根皮素抑制结肠癌细胞生长的分子机制。方法不同浓度根皮素(phlortin)处理结肠癌SW-480细胞24 h,CCK-8法检测细胞的存活率并计算IC50,倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡率,比色法检测细胞培养液中葡萄糖和乳酸浓度,荧光酶标仪检测细胞内ATP水平;Western Blot法检测各浓度根皮素对GLUT-1、糖酵解关键蛋白(HK2、PFKM)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、Thr172p-AMPK、P53、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)表达的影响。结果CCK-8检测结果显示,根皮素能明显抑制SW-480细胞的增殖(P<0.05),IC50为(22.44±1.3)μmol·L^-1。流式细胞术表明,根皮素能诱导G1期阻滞并促进凋亡(P<0.01,P<0.001)。比色法和荧光酶标仪检测结果显示,根皮素能限制SW-480细胞葡萄糖吸收和乳酸、ATP释放(P<0.01,P<0.0001),抑制有氧糖酵解。Western Blot检测结果表明,根皮素能下调GLUT-1、HK2、PFKM、Bcl-2蛋白(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.0001),上调P53、Bax、Caspase-3蛋白表达和Thr 172 p-AMPK、AMPK蛋白的比值(P<0.01,P<0.001,P<0.0001)。结论根皮素能够通过抑制GLUT-1蛋白表达限制SW-480细胞对葡萄糖的摄取,抑制细胞有氧糖酵解,最终激活AMPK-P53信号通路来诱导SW-480细胞凋亡,抑制其生长。

AMPK、p38 MAPK信号通路参与调控电刺激诱导骨骼肌细胞PGC-1α基因表达

目的采用急性电刺激(acute electrical stimulation)C2C12成熟肌管细胞模型,结合使用相关信号激酶通路特异性抑制剂,探究急性电刺激所诱发的细胞内信号激酶对PGC-1α基因表达的调控作用。旨在从细胞水平揭示肌肉收缩刺激调控PGC-1α基因表达的分子机制。方法体外培养小鼠成肌细胞系C2C12细胞,采用脂质体法分别转染含小鼠PGC-1α启动子DNA全序列的质粒(p2533)及装载有能够与PGC-1α全长基因序列相结合GAL4DNA结合区域的p Bind载体,细胞在转染后分化5-6 d形成成熟肌管,5 Hz,10 V强度急性电刺激2 h后即刻收集各组细胞,进行总蛋白或双荧光素酶检测。抑制剂处理组分别采用40μM Compound C(CC,AMPK抑制剂)与10μM BIRB796(BIRB,p38抑制剂)处理细胞。结果与对照组(CON)相比,电刺激组(STIM)细胞PGC-1α启动子活性显著增高52%(P<0.05),PGC-1α辅激活转录活性显著增高35%(P<0.05),同时伴随PGC-1α蛋白由细胞质向细胞核迁移的现象。此外,与CON组相比,STIM组细胞AMPK、p38信号激酶通路磷酸化水平显著上调(P<0.05),在分别采用AMPK、p38抑制剂处理后,其磷酸化水平显著受到抑制(P<0.01)。结论急性电刺激可诱导骨骼肌细胞PGC-1α转录水平以及翻译后蛋白水平活性上调,这一作用部分是通过AMPK或p38信号通路实现的。

LncRNA PFL通过AMPK-PPARα信号通路改善心肌纤维化

目的研究促纤维化长链非编码RNA(LncRNA PFL)改善压力负荷诱导的心肌纤维化同腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-过氧化物酶增殖激活的α亚型受体(PPAR)α信号通路的激活是否相关。方法将60只大鼠随机分为A(假手术)组、B(压力负荷诱导的心肌纤维化模型)组、C(压力负荷诱导的心肌纤维化模型+LncRNA PFL抑制剂)组。采用苏木素-伊红(HE)染色检测心肌组织的病理形态和纤维化程度,羟脯氨酸(HYP)检测心肌质量,Western印迹测定心肌组织中AMPK、PPARα蛋白水平。结果与A组比较,B组和C组心脏重量指数(HWI)和左心室重量指数(LVWI)均显著升高(P<0.01);与B组比较,C组显著下降(P<0.01)。HE染色结果:与A组比较,B组和C组心肌细胞的炎症浸润和细胞间胶原纤维均显著增加,神经元细胞损伤程度加重(P<0.05);与B相比,C组显著好转(P<0.05)。免疫荧光结果:B组AMPK及PPARα蛋白水平明显低于A组和C组,且C组明显低于A组。RT-qPCR及Western印迹结果:B组心肌组织中AMPK和PPARαmRNA及蛋白表达显著低于A组和C组,且C组显著高于A组(P<0.05)。结论LncRNA PFL表达下调改善压力负荷诱导的心肌纤维化与激活AMPK-α信号通路有关。

辣木异硫氰酸酯通过活化AMPK抑制3T3-L1脂肪细胞脂质积累

探究辣木异硫氰酸酯-4-[(α-L-rhamnosyloxy)benzyl]Isothiocyanates(MIC-1)抑制3T3-L1脂肪细胞脂质积累的作用及可能的调控机制。体外诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,用MIC-1干预48 h后检测细胞脂质积累情况,甘油三酯(TG)、甘油(Gly)和游离脂肪酸(FFA)含量;qRT-PCR检测脂代谢相关基因的表达;Western blot法测定腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白磷酸化水平和氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)蛋白表达水平。结果表明,MIC-1对3T3-L1前脂肪细胞存活率无影响;与对照组相比,MIC-1可降低脂肪细胞内脂滴分布及细胞着色程度,降低细胞内TG含量,减少FFA及甘油的溢出。MIC-1处理浓度达4μmol/L时,TG和FFA浓度分别下降64.00%和75.00%。同时,显著下调细胞中PPARγ(46.00%)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)(62.00%)的mRNA表达水平;显著上调AMPK蛋白磷酸化水平(64.47%)和下调PPARγ(52.10%)蛋白表达水平。以上结果表明,MIC-1通过促进TG分解和抑制TG的合成,从而抑制脂质积累,其机制可能与AMPK的活化有关。

AMPK信号通路在中老年肺癌患者恶性质胸腔积液中表达及临床意义

目的研究腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路在中老年肺癌患者胸腔积液中的表达,从分子水平探明其在良、恶性胸腔积液中的影响。方法以中老年肺癌患者胸腔积液为研究对象,其中恶性胸水78例,良性胸水42例;将良性胸水作为良性组,恶性(腺癌)胸水为恶性组,分别抽提两组细胞总RNA与总蛋白,RT-PCR检测肝激酶(LK)B1、AMPKα1和AMPKα2 mRNA表达情况,Western印迹检测LKB1、AMPKα1、AMPKα2和P-AMPKα蛋白表达情况。结果与良性组比较,恶性组LKB1、AMPKα1、AMPKα2 mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.01);与良性组比较,恶性组LKB1蛋白表达降低(P<0.001);AMPKα1、AMPKα2蛋白表达有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05);p-AMPKα水平表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论AMPK信号通路对鉴别良、恶性胸腔积液具有一定的临床提示价值。

乌司他丁通过AMPK/Nrf2通路对急性肺损伤新生大鼠肺组织保护作用的实验研究

目的:观察乌司他丁(UTI)通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)通路对高氧诱导的急性肺损伤(ALI)新生鼠的肺组织保护作用,并探究其可能的作用机制。方法:选取SPF级足月新生SD大鼠30只,随机分为对照组、ALI组和ALI+UTI组,每组10只。ALI组和ALI+UTI组大鼠置于高氧中建立ALI模型,ALI+UTI组大鼠腹腔注射10万U/kg的UTI 0.9%氯化钠溶液,对照组和ALI组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。处死各组大鼠,苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,计算肺组织湿干(W/D)比,采集支气管肺泡灌洗液(BALF),检测其中炎症因子的表达水平,检测肺组织中活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表达水平,RT-PCR法检测肺组织中相关基因mRNA的表达,Western blot检测其中相关蛋白的表达。结果:HE染色可见ALI组大鼠肺组织结构紊乱无规则,存在大量纤维渗出和炎性细胞浸润,而ALI+UTI组大鼠肺组织损伤程度明显改善。ALI组和ALI+UTI组大鼠肺W/D比高于对照组(均P<0.05),ALI+UTI组大鼠的肺W/D比低于ALI组(P<0.05)。ALI组和ALI+UTI大鼠BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表达水平均高于对照组(均P<0.05),ALI+UTI大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平低于ALI组(均P<0.05)。与对照组相比,ALI组和ALI+UTI组大鼠肺组织中ROS和MDA的表达显著升高、SOD的表达显著降低(均P<0.05);与ALI组相比,ALI+UTI组大鼠肺组织中ROS和MDA的表达显著降低、SOD的表达显著升高(均P<0.05)。ALI+UTI组大鼠肺组织中Nrf2及其下游基因血红素加氧酶1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO-1)mRNA的相对表达均高于对照组和ALI组(均P<0.05)。对照组和ALI组大鼠肺组织中pAMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达比较无统计学差异(均P>0.05);ALI+UTI组大鼠肺组织中pAMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达高于对照组和ALI组(均P<0.05)。结论:UTI可通过AMPK/Nrf2通路,激活AMPK磷酸化而增强Nrf2及其下游基因的活性,有效缓解高氧诱导的ALI,UTI可作为临床治疗ALI的备选药物之一。

脂肪细胞因子CTRP9通过激活AMPK信号通路改善心肌缺血-再灌注损伤

肥胖所致的脂肪细胞因子产生失衡是心血管疾病发病的一个重要原因。最近,日本名古屋大学Noriyuki Ouchi教授等的研究发现,脂肪细胞因子C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9（C1q/TNF-related protein 9,CTRP9）以腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）依赖的方式改善心肌缺血-再灌注损伤。

醋酸泼尼松对糖尿病肾病模型大鼠肾功能、肾脏炎性反应及AMPK/SIRT1信号通路的影响

目的探究醋酸泼尼松对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏炎性反应及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路的影响。方法随机选取12只大鼠作为对照组,将其余大鼠用高糖高脂饲料辅以腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建DN大鼠模型。将造模成功大鼠随机分为模型组、醋酸泼尼松低(6.25 mg/kg)、高(12.5 mg/kg)剂量组、醋酸泼尼松+CC组(醋酸泼尼松12.5 mg/kg+AMPK抑制剂compound C 0.2 mg/kg),每组12只。各组给予相应处理,1次/d,共给药4周。观察大鼠一般状态,检测空腹血糖(FBG)、24 h尿微量白蛋白(U-mAlb)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木精-伊红(HE)和高碘酸-希夫(PAS)染色观察肾脏组织病理形态学变化;蛋白免疫印迹法检测肾组织AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白的表达。结果醋酸泼尼松可改善DN大鼠一般状态,降低FBG、24 h U-mAlb、血清SCr、BUN、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、肾组织乙酰化核因子-κB p65(ac-NF-κB p65)/NF-κB p65和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)蛋白表达(P<0.05),升高磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK、SIRT1蛋白表达(P<0.05),改善肾脏病变;compound C可明显减弱醋酸泼尼松对DN大鼠的保护作用。结论醋酸泼尼松可减轻DN大鼠肾脏炎性反应,保护肾功能,其作用机制可能与激活AMPK/SIRT1通路,进而抑制NF-κB激活有关。

基于AMPK的中药有效成分治疗2型糖尿病的研究进展

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)在调节细胞和全身代谢中发挥着重要作用,是研究治疗2型糖尿病药物的关键靶点。本文介绍了AMPK的结构及调节方式,并通过检索文献,对通过调节AMPK及其相关信号通路干预2型糖尿病的中药有效成分进行归纳总结。

二甲双胍通过激活腺苷酸活化蛋白激酶/p53轴介导的线粒体功能诱导肿瘤细胞凋亡

目的:探讨二甲双胍(2型糖尿病的一线治疗药物)干预宫颈癌的疗效。方法:体外培养Caski细胞,不同浓度二甲双胍(2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)干预Caski细胞,设立对照(CON)组,二甲双胍(2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)干预组。分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、克隆形成实验、流式细胞术、DCFH-DA探针检测二甲双胍对Caski细胞增殖、凋亡、ROS产生的影响。应用蛋白质印迹法(Western blot)检测线粒体功能障碍的特异性蛋白以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/p53途径表达。结果:细胞学实验结果显示,CON组和二甲双胍(2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)干预组的A450值分别为0.98±0.10、0.85±0.10、0.58±0.08、0.46±0.04、0.38±0.03,组间差异有统计学意义(F=42.36,P<0.01);CON组和二甲双胍(2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)干预组的细胞凋亡率依次为(3.85±0.35)%、(8.55±0.62)%、(12.50±1.02)%、(20.56±2.36)%、(25.76±2.45)%,组间差异有统计学意义(F=56.74,P<0.01);CON组B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)/B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)(1.00±0.05),细胞色素C(Cyt C)(1.00±0.04),裂解的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)(1.00±0.03),Cyto Cyt C(1.00±0.03)和Mito Cyt C(1.00±0.05)浓度,与二甲双胍(2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)干预组比较(2.5 nmol/L组:bax/bcl-2:1.95±0.09,Cyt C:1.45±0.06,cleaved Caspase-3:1.65±0.05,Cyto Cyt C:1.46±0.06,Mito Cyt C:0.72±0.04;5.0 nmol/L组:bax/bcl-2:3.26±0.25,Cyt C:1.86±0.18,cleaved Caspase-3:1.92±0.24,Cyto Cyt C:1.84±0.21,Mito Cyt C:0.65±0.03;10.0 nmol/L组:bax/bcl-2:4.14±0.28,Cyt C:2.25±0.25,cleaved Caspase-3:2.38±0.28,Cyto Cyt C:2.26±0.25,Mito Cyt C:0.53±0.03;20.0 nmol/L组:bax/bcl-2:6.18±0.36,Cyt C:3.65±0.42,cleaved Caspase-3:3.42±0.36,Cyto Cyt C:2.98±0.32,Mito Cyt C:0.42±0.02),组间差异有统计学意义(P<0.05);与CON组比较[磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK:1.00±0.06,p-p53/p53:1.00±0.05],二甲双胍治疗后p-AMPK/AMPK(2.5 nmol/L组:1.65±0.12;5.0 nmol/L组:1.98±0.23;10.0 nmol/L组:2.32±0.22;20.0 nmol/L组:2.86±0.24)和p-p53/p53蛋白水平(2.5 nmol/L组:1.54±0.11;5.0 nmol/L组:1.86±0.19;10.0 nmol/L组:2.01±0.25;20.0 nmol/L组:2.35±0.25)显著上升(P<0.05)。结论:二甲双胍治疗激活了AMPK/p53通路,从而抑制Caski细胞活力,提高凋亡细胞百分率和促进ROS生产。

微RNA-375-5p对心力衰竭大鼠的保护作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-375-5p对心力衰竭(HF)大鼠的保护作用及相关机制。方法将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+Compound C(CC)组,每组10只。HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+CC组大鼠腹腔注射阿霉素溶液制备HF模型,假手术组大鼠腹腔注射等量的NaCl溶液。造模结束后次日,miR-375-5p组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL,miR-NC组大鼠经尾静脉注射miR-NC mimics 100μL,假手术组和HF组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水,miR-375-5p+CC组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂CC(0.2 mg·kg^(-1));各组大鼠均每日给药1次,连续给药4周。使用彩色多普勒超声仪检测各组大鼠心功能指标,反转录聚合酶链反应检测各组大鼠心肌组织中miR-375-5p表达,酶联免疫吸附试验检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平,苏木精-伊红染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况,蛋白质印迹检测各组大鼠心肌组织中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、AMPK、沉默信息调节因子3(SIRT3)蛋白的相对表达量。结果与假手术组比较,HF组、miR-NC组和miR-375-5p组大鼠的左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。miR-NC组与HF组大鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率、血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、GSH水平、SOD活性、心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量及SIRT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与HF组相比,miR-375-5p组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平、心肌组织中p-AMPK/AMPK及miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著升高,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著降低(P<0.05)。与miR-375-5p组相比,miR-375-5p+CC组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。假手术组大鼠心肌细胞规律排列,细胞核明显且无炎症细胞浸润;HF组大鼠心肌细胞形态发生明显改变,排列紊乱,细胞间隙变大,染色变浅,且出现心肌纤维化,有大量的炎症细胞浸润,HF组和miR-NC组大鼠心肌组织病理学变化无明显差异;与HF组相比,miR-375-5p组大鼠心肌细胞排列明显有序,细胞坏死程度和范围明显减少;miR-375-5p+CC组与HF组大鼠心肌组织病理学变化相似。结论miR-375-5p能抑制HF大鼠心肌细胞凋亡,进而对HF大鼠发挥保护作用,其机制可能与激活AMPK/SIRT3信号通路有关。

促卵合剂调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路改善卵泡发育不良大鼠氧化应激及凋亡的作用机制

目的:探讨促卵合剂通过调控腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子(AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF)通路改善卵泡发育不良(FM)大鼠氧化应激及凋亡的作用机制。方法:将48只雌性SD大鼠随机分为正常组8只,造模组40只,造模组大鼠连续灌胃雷公藤多苷混悬液(75 mg·kg^(-1))30 d进行造模,造模后随机分为模型组、克罗米芬组(4.5 mg·kg^(-1))、促卵合剂低、中、高剂量组(8.1、16.2、32.4 g·kg^(-1)),每组8只。相应剂量药物给药,正常组及模型组灌胃等体积灭菌水,连续干预14 d。巴氏染色检测各组大鼠动情周期变化;苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理学及卵泡计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)含量;化学荧光法检测卵巢组织中活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡率;免疫组化法检测卵巢组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,次级、成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多,血清FSH及LH含量,卵巢组织ROS含量、Bax表达、卵巢颗粒细胞凋亡率、AMPK mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2表达、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,克罗米芬组及促卵合剂高、中剂量组次级卵泡和成熟卵泡增加,闭锁卵泡显著减少,血清FSH及LH含量、卵巢组织ROS含量、Bax表达、细胞凋亡、AMPK mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01)。结论:促卵合剂可能通过调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路来抑制氧化应激减少颗粒细胞凋亡,促进卵泡正常发育成熟,减少卵泡闭锁,保护卵巢功能,进而对FM发挥治疗作用。

基于“以方测证”理论从AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路探讨雷公藤多苷诱导卵泡发育不良大鼠模型的中医证候属性

目的:采用雷公藤多苷诱导卵泡发育不良大鼠模型,基于“以方测证”理论从腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子(AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF)信号通路探索该模型的证候属性。方法:将48只具有规律动情周期大鼠随机分为正常组(n=8)和造模组(n=40),造模组大鼠连续灌胃雷公藤多苷混悬液(75 mL·kg^(-1))30 d,造模后将其分为模型组、四物汤组(3.69 g·kg^(-1))、右归饮组(3.11 g·kg^(-1))、左归饮组(7.29 g·kg^(-1))和归肾丸组(10.35 g·kg^(-1)),每组8只。相应药物干预14 d。巴氏染色检测各组大鼠动情周期变化;体视镜观察卵巢组织形态;苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理学及卵泡计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织AMPK、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,次级、成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多,FSH、LH、AMPK mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),E2含量,mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,归肾丸组次级、成熟卵泡增多,闭锁卵泡减少,FSH、LH含量、AMPK mRNA表达及蛋白表达显著降低(P<0.01),E2含量、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA表达及蛋白表达显著升高(P<0.01)。与归肾丸组比较,四物汤组、右归饮组、左归饮组成熟卵泡数量显著减少,闭锁卵泡数量显著增多(P<0.01);四物汤组、右归饮组、左归饮组LH显著升高(P<0.01),FSH明显升高(P<0.05),E2明显降低(P<0.05);右归饮组AMPK蛋白表达明显升高(P<0.05),mTOR和HIF-1 mRNA表达显著降低(P<0.01),VEGF蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.01);四物汤组mTOR和HIF-1 mRNA,VEGF蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05);左归饮组mTOR mRNA和VEGF蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论:归肾丸可以抑制AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路来改善卵泡发育不良大鼠模型的卵巢功能、促进卵泡成熟,且总体疗效优于左归饮、右归饮和四物汤,表明该模型的证候更符合肾精亏虚证。

基于AMPK信号通路探讨芪术方改善非酒精性脂肪性肝炎的机制

目的:基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路探讨芪术方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝脏脂质代谢及氧化应激的改善与作用机制。方法:60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组10只,造模组50只。造模组采用高脂高胆固醇饲料喂养16周造成NASH小鼠模型后,随机分为模型组、芪术方低、中、高剂量组、易善复组各10只。芪术方各组按4.75、9.50、19.00 g·kg^(-1)剂量、易善复组按228 mg·kg^(-1)剂量行每日1次灌胃,正常组和模型组予等体积纯水,连续给药8周。检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、葡萄糖(GLU)水平;苏木素-伊红(HE)和油红O染色观察肝组织病理变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、游离脂肪酸(FFA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝组织乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)、线粒体解偶联蛋白2(UCP2)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝组织AMPK、p-AMPK、ACC、CPT1A、UCP2蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠肝脏脂肪变性明显,可见多处炎症聚集灶,胞内出现大量脂质沉积,血清AST、ALT活力,IL-6、IL-1β、TNF-α、FFA、MDA水平显著升高,CAT、SOD活力显著降低,ACC mRNA及蛋白表达显著升高,CPT1A、UCP2 mRNA及蛋白表达显著降低,p-AMPK蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,芪术方各剂量组及易善复组小鼠肝脏脂肪变性程度减轻,血清AST、ALT活力,IL-6、IL-1β、TNF-α、FFA、MDA水平显著降低,CAT、SOD活力显著升高(P<0.01),芪术方中、高剂量组小鼠肝组织ACC mRNA及蛋白表达显著降低,CPT1A、UCP2 mRNA及蛋白,p-AMPK蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:芪术方可通过激活AMPK信号通路,改善NASH小鼠肝脏脂质代谢,减少氧化应激,促进肝细胞修复。

基于AMPK/mTOR信号通路介导自噬探讨中医药治疗心力衰竭的机制研究进展

心力衰竭(HF)是一种由心脏功能障碍引起心室泵血功能受损的一组综合征,严重影响患者的健康和生活质量。HF的发病机制复杂,包括心肌收缩力减退、心肌细胞纤维化和心室重构等多个方面,并与神经内分泌调节、炎症反应及心肌细胞自噬等多种因素有关。自噬是一种细胞通过自我降解的方式,以维持机体稳态的重要调节机制。在HF的进程中,适度的自噬能够清除老化和受损的心肌细胞、维持心肌能量代谢平衡,而异常的自噬则可能会导致心肌细胞的功能减退和病理性改变。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素哺乳靶蛋白(mTOR)则是调控自噬的经典通路之一,可以通过调控AMPK/mTOR信号通路介导心肌细胞自噬过程,起到保护心脏功能,延缓HF进程的作用。中医药在历史长河中不断发展和创新,有着独特的理论体系,并在与现代医学的交汇下表现出卓越的疗效与广泛的应用前景。临床实践中,中医药在治疗心血管疾病方面有着丰富经验,大量国内外研究表明,许多中药有效成分、中药复方及中成药可以通过调节AMPK/mTOR信号通路介导自噬以达到治疗HF的目的。笔者从AMPK/mTOR信号通路介导自噬的作用机制出发,阐释该机制在治疗HF过程中的关键作用,并基于中医相关理论探讨对自噬、AMPK/mTOR信号通路和HF的理解,同时对中医药通过AMPK/mTOR通路调控自噬治疗HF进行了综述,以期深入挖掘中医药在心血管疾病治疗中的潜力,为后续实验研究提供理论支持,并在临床上展现中医优势,实现更加精准化的治疗。

基于AMPK/mTOR自噬通路探讨芍药苷保护溃疡性结肠炎小鼠的作用机制

目的:探讨芍药苷通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的保护作用机制研究。方法:自由饮用4%葡聚糖硫酸钠(DSS)建立UC小鼠模型,56只BALB/c雄性小鼠,随机分为模型组、AMPK抑制剂组(20 mg·kg^(-1))、芍药苷(50 mg·kg^(-1))+抑制剂(20 mg·kg^(-1))组、芍药苷高剂量组(50 mg·kg^(-1))、中剂量组(25 mg·kg^(-1))、低剂量组(12.5 mg·kg^(-1))药物干预7 d后,通过比较小鼠体质量、疾病活动指数(DAI)变化和苏木素-伊红(HE)染色结果判断芍药苷对UC的保护作用。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平,免疫荧光检测结肠中微管相关蛋白1轻链3(LC3)的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中AMPK、mTOR蛋白及其磷酸化蛋白p-AMPK、p-mTOR,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测AMPK、mTOR、Beclin1、LC3和p62的mRNA表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠体质量下降、DAI评分升高、结肠出现严重的病理学损伤,炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量上升(P<0.01),LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平下调,p-mTOR/mTOR蛋白水平上调(P<0.01);AMPK、LC3的mRNA表达水平下调,mTOR、p62的mRNA表达上调(P<0.01)。与模型组和芍药苷+抑制剂组比较,经芍药苷治疗后小鼠体质量上升、DAI评分降低、结肠组织病理损伤减轻,炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量下降(P<0.05),LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平上调,p-mTOR/mTOR蛋白水平下调(P<0.01),AMPK、Beclin1、LC3的mRNA表达水平上调,mTOR、p62的mRNA表达下调(P<0.01),抑制剂组小鼠结肠组织病理损伤严重,各项指标趋势与芍药苷高剂量组完全相反。结论:芍药苷可通过激活AMPK/mTOR信号通路,增强自噬,减轻UC小鼠的炎症损伤,从而起到保护作用。