槲皮素对胃癌相关p53/AMPK/mTOR信号通路的影响

目的探讨槲皮素(QE)对胃癌相关p53/AMPK/mTOR信号通路的影响。方法将胃癌细胞分为QE组和溶剂组,QE组以DMSO为溶剂按配制QE浓度分别为0.02、0.04、0.06及0.08 mmol/L,对细胞进行干预,分别为QEA、QEB、QEC、QED组,溶剂组加入等量不含QE的溶剂。MTT实验检测槲皮素对胃癌细胞增殖的影响;MDC染色法检测槲皮素对胃癌细胞自噬的影响;双染法检测槲皮素对胃癌细胞凋亡的影响;实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞内p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平;Western blot检测细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P53、AMPK、mTOR蛋白表达差异。结果与溶剂组相比,QE各剂量组胃癌细胞的自噬程度和凋亡率均显著增加,细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量上调,p53、AMPK mRNA和蛋白水平均上调,mTOR的mRNA和蛋白表达量均下调(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论QE可以抑制胃癌细胞增殖,诱导其发生自噬、促进其凋亡,其作用机制可能与p53/AMPK/mTOR信号通路有关。

基于p53/AMPK/mTOR信号通路调控细胞自噬探讨益气扶正解毒汤抑制Lewis肺癌小鼠皮下肿瘤生长的作用机制

目的观察益气扶正解毒汤(YQT,黄芪、麦冬、黄芩等)对Lewis肺癌小鼠皮下肿瘤生长的影响,并基于p53/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控细胞自噬探讨其可能的作用机制。方法采用Lewis肺癌细胞构建C57BL/6小鼠皮下肿瘤模型,随机分为模型组、顺铂组(3 mg·kg^(-1))及YQT低、中、高(8.7、17.4、34.8 g·kg^(-1))剂量组,每组8只。造模后第7天开始,YQT组予以相应剂量灌胃给药,每日1次,连续21 d。采用HE染色法观察肿瘤组织的病理变化;免疫组化法检测肿瘤组织Ki67的表达;透射电镜检测肿瘤组织自噬小体数量;RT-PCR法检测肿瘤组织自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5、Atg7 mRNA表达水平;Western Blot法检测LC3、Beclin-1、p62、Atg5、Atg7和p53/AMPK/mTOR通路蛋白表达水平。结果与顺铂组比较,YQT高剂量组的抑瘤率无明显差异(P>0.05)。与模型组比较,YQT各剂量组小鼠皮下肿瘤的体积明显缩小(P<0.05),肿瘤质量均明显降低(P<0.05),病理切片显示肿瘤组织有较多的坏死区域,肿瘤组织中的自噬小体数量明显增加,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5蛋白表达明显上调(P<0.05);YQT中、高剂量组小鼠肿瘤组织中Ki67蛋白表达明显下调(P<0.05),Atg7、p53、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK蛋白表达明显上调(P<0.05),p62、磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR蛋白表达明显下调(P<0.05);YQT高剂量组小鼠肿瘤组织的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 mRNA表达明显上调(P<0.05)。结论YQT可能通过p53/AMPK/mTOR信号通路上调细胞自噬水平,抑制Lewis肺癌小鼠皮下肿瘤生长及肿瘤细胞增殖。

通窍明目汤通过p53/AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬改善青光眼视网膜神经节细胞损伤的机制研究

目的观察通窍明目汤对青光眼视网膜神经节细胞(RGC)氧化应激损伤的作用机制及其对p53/AMPK/mTOR通路所介导的RGC自噬的影响。方法采用CCK-8法检测RGC增殖率,流式细胞术检测RGC凋亡率,免疫荧光检测RGC内活性氧(ROS)表达,ELISA法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量及活性,Western blot检测RGC中Beclin-1、p62表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p53/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组RGC增殖率下降,RGC凋亡率升高;ROS阳性细胞数量增加,SOD活性、MDA和GSH-PX含量升高,模型组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、细胞核p53、p-AMPK及mTORC1表达升高,p62、细胞质p53、AMPK及p-mTORC1蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,各浓度通窍明目汤组RGC增殖率升高,RGC凋亡率下降;RGC中ROS阳性细胞数量减少;SOD活性,MDA和GSH-PX含量降低,与模型组相比,各剂量通窍明目汤组及PFT-ɑ组细胞p62、细胞质p53、AMPK及p-mTORC1蛋白表达升高,Beclin1表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、细胞核p53、p-AMPK及mTORC1表达降低(P<0.05)。结论通窍明目汤可通过介导p53/AMPK/mTOR信号通路上调RGC自噬水平,从而抑制青光眼视神经萎缩的进展。

核外p53通过AMPK/mTOR信号抑制自噬并促进热打击诱导的血管内皮细胞损伤

目的阐明核外p53通过调控蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶体(mTOR)信号通路介导自噬抑制在热打击后血管内皮细胞(VECs)损伤的分子机制。方法实验分为:对照组、热打击组、热打击组+Compound C组、热打击组+rapamycin组、热打击组+PFT组,并分别使用AMPK抑制剂Compound C、mTOR抑制剂(自噬激活剂)rapamycin、p53线粒体转位抑制剂PFT预处理细胞或C57BL/6小鼠,通过CCK8法检测细胞活力,Western blot观察p53线粒体移位、自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPK/mTOR信号通路的激活情况,HE染色观察各组小鼠主动内皮血管病理改变,TUNEL染色观察各组小鼠动内皮血管凋亡情况。结果与对照组相比,热打击后主动脉内皮细胞(MAECs)活力显著下降(P<0.05),热打击后小鼠主动脉血管内皮细胞肿胀、脱落,内弹力膜断裂,平滑肌排列紊乱,可见大量凋亡细胞;热打击后随着复温时间(0、3、6、9 h)延长,MAECs胞浆中p53表达逐渐减弱,而线粒体p53表达逐渐增强;热打击后(6 h)LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达被抑制,p62蛋白表达增加(P<0.05);热打击后(6 h)AMPK的磷酸化被抑制,mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化表达增加(P<0.05)。AMPK抑制剂Compound C明显抑制了热打击后MAECs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,促进了p62蛋白表达,并加重了热打击后小鼠主动脉血管的损伤以及促进了凋亡的增加,而mTOR抑制剂rapamycin均呈现相反作用。p53线粒体转位抑制剂PFT促进了AMPK的磷酸化激活,并抑制mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化(P<0.05);使用PFT后促进了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达,抑制了P62的表达(P<0.05);使用PFT后明显提高了MAECs的细胞活力(P<0.05),也减轻了热打击后小鼠主动脉血管的损伤和凋亡的发生。结论核外p53主要通过抑制AMPK活性,激活mTOR信号,继而介导细胞自噬抑制,参与热打击诱导的MAECs损伤。

芦荟大黄素对胃癌SGC-7901细胞凋亡、自噬及p53/AMPK/m TOR信号通路的影响

目的:探讨芦荟大黄素(AE)对胃癌SGC-7901细胞凋亡、自噬及p53蛋白(p53)/磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路的影响。方法:实验分为对照组(AE 0μmol·L^-1)、AE低(10μmol·L^-1)、中(30μmol·L^-1)、高(50μmol·L^-1)剂量组和自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+AE组(20μmol·L^-1+50μmol·L^-1)。CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率,采用透射电镜及单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察各组细胞自噬体及自噬溶酶体的变化,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定(TUNEL)法观察各组细胞凋亡率变化,Western blot法检测各组细胞p53、AMPK、m TOR信号通路蛋白及自噬标致蛋白Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相关轻链蛋白Ⅰ(LC3Ⅰ)及微管相关轻链蛋白Ⅱ(LC3Ⅱ)表达情况。结果:与对照组相比,AE各剂量组及3-MA+AE组细胞的增殖抑制率、凋亡指数(AI)显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;AE中、高剂量组的增殖抑制率和AI与3-MA+AE组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,AE各剂量组细胞自噬体、自噬空泡增多,溶酶体积分光密度(IOD)/所选区域面积(Area)值及p53、AMPK、Beclin-1表达显著升高,m TOR表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;3-MA+AE组细胞自噬体、自噬空包等超微结构减少,IOD/Area值及p53、AMPK及Beclin-1表达显著降低,m TOR表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著升高(P<0.05)。结论:AE可通过提高胃癌SGC-7901细胞自噬水平,诱导SGC-7901细胞凋亡,其机制可能与促进p53/AMPK/m TOR信号通路表达有关。

从AMPK/mTOR通路探讨人参-三七-川芎提取物对糖尿病小鼠心脏老化的保护作用机制

目的:从AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的活化及心脏病理形态学变化、相关衰老蛋白的改变,探讨人参-三七-川芎提取物(GNC)对糖尿病小鼠心脏老化的保护作用机制。方法:C57BL/6雄性小鼠,SPF级,随机分为正常组和高糖组。高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)联合喂食高脂饲料,造模成功后再次随机分为模型组,GNC低剂量组(0.819 g·kg^-1),GNC高剂量组(1.638 g·kg^-1)及二甲双胍组(150 mg·kg^-1)。每天1次,灌胃给药,连续9周,监测血糖变化。4周龄雄性C57BL/6小鼠正常喂养1周,为青年组。观察小鼠一般情况,苏木素-伊红(HE)染色结合透射电镜(TEM)观察小鼠心脏病理形态学变化,冯库萨(Von Kossa)染色判断小鼠心脏微血管钙盐沉积程度,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠心脏组织中AMPK/mTOR信号通路活化状态,以及衰老相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2),抑癌基因p53(p53),磷酸化抑癌基因p53(p-p53)表达。结果:与正常组比较,模型组血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组血糖明显下降(P<0.05,P<0.01)。HE,TEM,Von Kossa 3个病理形态学实验结果显示:与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞肥大,心肌纤维排列紊乱、灶性溶解坏死,线粒体肿胀、变性、嵴断裂、空泡变,心脏微血管结构紊乱、染色不均匀、中内膜有大量钙盐沉积;与模型组比较,各给药组小鼠病理形态学变化均有不同程度的改善。与正常组比较,模型组MMP-2,p53和p-p53蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),p-肝激酶B1(LKB1)/LKB1,p-AMPK/AMPK蛋白明显降低(P<0.05,P<0.01),p-mTOR/mTOR,p-核糖体蛋白S6激酶p70S6K/p70S6k蛋白显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组MMP-2,p53和p-p53蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),p-LKB1/LKB1,p-AMPK/AMPK蛋白明显升高(P<0.05,P<0.01),p-mTOR/mTOR,p-p70S6k/p70S6k蛋白明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:STZ联合高脂饲料能够诱导小鼠心脏老化,GNC能够改善糖尿病小鼠心脏老化,其作用机制可能与调控AMPK/mTOR通路相关蛋白表达有关。