p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、Bax和MDM2表达的影响

目的探讨p53抑制剂PFT-α(pifithrinalpha,PFT-α)对热化疗诱导原代培养结肠上皮细胞凋亡及p53靶基因Bax和MDM2表达的影响。方法原代培养结肠上皮细胞分为正常对照组、热化疗组和PFT-α加热化疗组,运用顺铂联合温热(43℃)处理结肠上皮细胞30min,对比加入不同浓度的PFT-α后,AnnexinV-FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。MTT法分析PFT-α对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。Westernblot检测结肠上皮细胞的p53、Bax和MDM2蛋白表达。结果热化疗导致结肠上皮细胞发生凋亡,Bax和MDM2蛋白表达明显高于对照组。PFT-α作用于顺铂联合温热处理结肠上皮细胞后,细胞凋亡率下降呈剂量依赖性,同时p53在结肠上皮细胞胞核/胞质表达比例下降,Bax和MDM2的表达逐渐降低。热化疗杀伤肿瘤细胞的效应并未受到低剂量PFT-α影响。结论PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞具有保护作用,其机制可能与改变p53核转位和抑制促凋亡基因Bax和MDM2的表达相关,抑制p53可作为克服热化疗抗肿瘤治疗副效应的新策略。

p53抑制剂PFT-α对犬博卡病毒感染致靶细胞病变的影响

目的探讨p53抑制剂(pifithrin alpha,PFT-α)对犬博卡病毒(minute virus of Canine,MVC)感染致WRD细胞(walter reed canine,WRD)病变的影响。方法首先MVC感染WRD细胞72h后,DAPI染色并观察靶细胞的形态学变化;给予不同浓度梯度的PFT-α处理WRD细胞,MTS法检测PFT-α对WRD细胞的毒性作用,以确定PFT-α的安全使用剂量;利用安全剂量的PFT-α分别采取提前(MVC感染前1h)或同时与病毒感染靶细胞,MTS试剂法检测PFT-α加入的不同方式对博卡病毒MVC感染致靶细胞病变的影响;以不同MVC感染复数(multiplicity of infection,MOI)处理WRD细胞,观察PFT-α在安全剂量和最佳处理方式作用下对MVC感染致靶细胞WRD病变的影响。结果 MVC感染致WRD细胞发生明显的凋亡等病理性改变;20μmol·L-1的PFT-α浓度是WRD细胞的安全使用剂量;安全剂量的PFT-α加入能够明显提高受感染细胞的细胞活力,与对应感染组相比差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 PFT-α能够降低犬博卡病毒感染致WRD细胞病变的程度。

P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体核转运的影响

目的:探讨P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体(GR)核转运的影响。方法:分离和培养银屑病患者和正常人表皮角质形成细胞,分别与P53抑制剂和微管蛋白抑制剂共培养,加或不加血管内皮细胞生长因子(VEGF),间接免疫荧光法检测上述因素对GR核转位的影响。结果:VEGF可诱导正常角质形成细胞发生核转位;P53抑制剂抑制了VEGF诱导的GR核转位。与VEGF共培养的角质形成细胞的核转位评分显著低于单纯角质形成细胞的核转运评分,差异有统计学意义(P<0.05);微管抑制剂可完全将正常表皮角质形成细胞的GR滞留在胞浆中,在加入VEGF后,与单纯微管抑制剂组比较,胞浆中GR并没有明显增多;而微管抑制剂和P53抑制剂共培养,会有少量GR进入角质形成细胞的胞核中。结论:微管介导银屑病角质形成细胞GR的核摄取,P53参与了GR的核输出。

p53-MDM2结合抑制剂药效团模型的构建

采用Catalyst软件,选择5类共24个p53-MDM2结合抑制剂作为训练集,经计算机建模、构象优化。由Catalyst系统构建出药效团模型,并对药效团进行有效性分析,结合已知的p53-MDM2结合抑制剂的结构信息,筛选得到含有一个芳环中心、三个疏水中心和一个氢键受体的具有较好预测能力(Correl=0.941,Config= 17.530,Δcost=150.830)的药效团模型.

小分子p53-MDM2抑制剂先导化合物苄普地尔的研究

目的采用老药新用药物设计方法,探寻p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂的先导化合物。方法通过荧光偏振(FP)法和蛋白印迹试验法,分别测定化合物的p53-MDM2蛋白结合抑制活性和相关蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测试其体外抗肿瘤活性,并且测定人肝微粒体中代谢产物。结果发现苄普地尔具有优秀的体外抗肿瘤活性和较强的p53-MDM2蛋白结合抑制活性,能显著降低MDM2蛋白的表达,而且呈剂量依赖性。在人肝微粒体中的代谢产物主要为苯环羟基单氧化代谢产物。结论苄普地尔可作为p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂先导化合物,用于后续的结构优化设计研究。

P53蛋白在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤和血管痉挛中的作用

p53是重要的肿瘤抑制因子,在细胞内起着抑制细胞周期、促进基因组修复和诱导凋亡等多重作用。在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后,p53在缺氧等多种因素作用下被激活,并通过其靶蛋白、Bcl-2和Caspase家族蛋白等发挥促血管内皮细胞及脑内神经元凋亡的作用,并导致SAH后早期脑损伤和后期血管痉挛的发生。应用p53特异性的抑制剂可以阻断p53的活化,显著恢复SAH后的血脑屏障功能并缓解脑血管痉挛。本文讨论了p53在SAH后的血管内皮细胞和神经元凋亡中的作用机制,并进一步探讨应用p53抑制剂拮抗p53功能以治疗SAH后早期脑损伤和血管痉挛的可能性。

干扰p53-MDM2蛋白相互作用的小分子抑制剂的研究进展

p53-MDM2蛋白相互作用是抗肿瘤药物研究的重要作用靶点,抑制p53-MDM2结合是激活p53的有效途径。大量的药物筛选方法和手段已经用于寻找p53-MDM2相互作用的新型抑制剂,其中小分子抑制剂是最具前景的研究领域之一。该文总结了近年来国内外p53-MDM2蛋白结合小分子抑制剂的研究进展。

重组质粒pEGFP-N2/XPD转染条件及Pifithrin-α孵育条件的探索

目的探讨重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染条件和Pifithrin-α（P53抑制剂）的孵育条件。方法利用脂质体将质粒pEGFP-N2/XPD在不同质粒浓度时转染细胞以及转染后分别孵育不同时间,然后进行RT-PCR和Western blot检测着色性干皮病基因D（XPD）的表达。将Pifithrin-α在不同浓度时孵育细胞以及分别孵育细胞不同时间,然后进行MTT检测。结果 XPD的表达在质粒浓度为0~4μg·孔-1范围内呈剂量依赖性升高（P〈0.01）,而质粒浓度达到4μg·孔-1以后XPD的表达不再随浓度的增加而继续升高;转染后细胞孵育时间为48h时XPD mRNA的表达为最高（P〈0.05）,转染后细胞孵育时间为72h时XPD蛋白的表达为最高（P〈0.01）。细胞增殖活力在Pifithrin-α浓度为0~20μmol·L-1范围内呈剂量依赖性升高（P〈0.05）,而Pifithrin-α浓度达到20μmol·L-1以后细胞增殖活力不再随浓度的增加而继续升高;细胞增殖活力在Pifithrin-α孵育时间为0~24h范围内呈时间依赖性升高（P〈0.01）,而Pifithrin-α孵育时间达到24h以后细胞增殖活力不再随孵育时间的增加而继续升高。结论在后续的研究中,将以浓度为4μg·孔-1的pEGFP-N2/XPD质粒转染HepG2.2.15细胞,转染后的第2天以浓度为20μmol·L-1的Pifithrin-α孵育细胞24h,转染后共孵育细胞48h。

癌基因iASPP-SV参与乳腺癌的形成

背景与目的:p53凋亡刺激蛋白抑制剂(inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53,i ASPP)属于ASPP家族成员,其与p53结合,抑制p53靶基因的转录活性,抑制细胞凋亡,与肿瘤形成相关。先前该研究所在课题组发现了i ASPP的一个新亚型i ASPP剪切变异体(i ASPP splice variant,i ASPP-SV),其是包含407个氨基酸残基的核蛋白,能与p53结合、抑制p53的转录活性,但是其与乳腺癌细胞增殖的作用还不清楚。因此,该研究旨在探讨i ASPP-SV在乳腺癌发生、发展中的作用。方法:用5’-基因末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)方法检测乳腺癌细胞系MCF-7的i ASPP-SV m RNA的5’末端序列。将p FLAG-i ASPP-SV和p FLAGi ASPP(828)分别转染HEK 293细胞,采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测HEK293细胞及8种人类肿瘤细胞i ASPP-SV的表达情况。建立稳定表达FLAG-i ASPP-SV和FLAG-i ASPP(828)的NIH 3T3细胞系,细胞增殖分析、克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测i ASPP-SV、i ASPP(828)是否促进细胞增殖、是否是癌基因。用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reactive,RTFQ-PCR)的方法检测原发性乳腺癌i ASPP-SV和i ASPP(828)m RNA表达水平,确定人乳腺癌中i ASPP-SV是否上调。用荧光素酶报告基因实验检测i ASPP-SV、i ASPP(828)、p53与NF-κB/p65的关系。结果:5’-RACE方法显示,MCF-7细胞中的i ASPPSV由RAI序列(DQ986418.1)编码。Western blot实验显示,多种人类肿瘤细胞系表达内源性i ASPP-SV。细胞增殖分析、克隆形成实验和软琼脂集落形成实验证实i ASPP-SV与i ASPP(828)能促进肿瘤细胞增殖,是癌基因。RTFQ-PCR实验显示,p53野生型乳腺癌组织i ASPP-SV表达水平的中位值比p53突变型显著升高。荧光素酶报告基因实验证实i ASPP-SV、i ASPP(828)能抑制NF-κB/p65转录,因此i ASPP可能是双功能蛋白。结论:i ASPP-SV可能作为乳腺癌治疗的有效靶点。

X射线诱导NSCLC组织Axin表达并通过p53或JNK途径促进细胞凋亡

目的研究X-射线对非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)组织中Axin表达的作用,以及X射线上调Axin表达的机制。方法应用Westernblot、RT-PCR方法检测15例经过X射线照射后NSCLC组织中Axin在蛋白水平及RNA水平的表达变化情况以及caspase-3活化情况。转染Axin及AxinΔp53ΔHIPK2至A549、BE1细胞中,并施加p53或JNK抑制剂,细胞经X线照射后用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,研究Axin上调细胞凋亡的机制。结果经X射线照射后,在15例NSCLC肺癌组织中,有8例Axin在RNA水平和蛋白水平上表达上调,与Axin未上调组相比,细胞凋亡显著增加(P<0.05)。转染Axin能使A549、BE1细胞凋亡明显增加,AxinΔp53ΔHIPK2不能上调A549细胞凋亡,p53抑制剂和JNK抑制剂分别抑制A549和BE1细胞凋亡。结论 X射线诱导部分NSCLC组织Axin表达增加并促进细胞凋亡,Axin通过p53或JNK途径促进X射线诱导的细胞凋亡。检测NSCLC组织中是否存在p53基因突变并不能作为判定是否对X射线敏感的指标。

p53在黑素细胞对抗紫外线或H2O2诱导的氧化应激中的作用

目的通过紫外线照射（UVR）或过氧化氧（H2O2）对人黑素细胞p53的表达影响，并使川p53激活剂顺式咪唑啉衍生物-3（nutlin3）和p53抑制剂（PFT-α）对人黑素细胞UVR或H2O2的氧化应激脱氧核糖核酸（DNA）损伤的影响，探讨p53在人黑素细胞对抗氧化应激中的作用。方法Western印迹法测定UVR、不同浓度H2O2、nutlin3和PFT-α处理后的人黑素细胞p53表达；单细胞电泳实验（彗星分析）测定nutlin-3或PFT-α对人黑素细胞UVR或H2O3氧化成激DNA损伤的影响；7-H2AX免疫荧光实验测定nutlin-3对人黑素细胞UVR氧化应激DNA损伤的影响。结果Western印迹结果屁示UVR、H2O2可以增加人黑素细胞总p53的表达，并且足伴随着15丝氨酸磷酸化t）53的增高而增高，nutlin-3和PFT—α分别增加和减少人黑索细胞内p53表达；墙壁分析显示．预先使用nutlin-3可以明显减少UVR或H2O2造成的DNA损伤的尾素，PFT—α明娃增加UVR或H2O3造成的DNA损伤的尾素，差异具有统计学意义（P〈0．05）；流式细胞仪分析最示预先使用nutlin-3可以减少UVR造成的7H2AX表达。结论p53在人黑素细胞对抗UV或H2O2诱导的氧化应激中起着重要的作用。

Circ0066629促进结直肠癌细胞活力的体外研究

目的探讨环状RNA circ0066629促进结直肠癌细胞活力作用及其调控的分子机制。方法 35例结直肠癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)及伊立替康耐药和不耐药患者组织来源于南京医科大学附属上海市松江中心医院,不同结直肠癌细胞系来源于美国菌种保藏中心,利用RT-q PCR测定circ0066629在结直肠癌组织及细胞系中的表达水平。Circ0066629过表达质粒、siRNA质粒、miR-219a-2-3p过表达质粒(miR-219a-2-3p mimics)及miR-219a-2-3p干扰质粒(miR-219a-2-3p inhibitor)用于调控circ0066629和miR-219a-2-3p的表达。RT-q PCR用于测定转染效率。随后,应用CCK-8和细胞划痕实验测定LOVO细胞活力。荧光素酶报告基因实验用于评估circ0066629与miR-219a-2-3p以及p53与miR-219a-2-3p的靶向关系。蛋白免疫印迹实验用于测定p53和鼠双微体基因2(MDM2)在LOVO细胞中的蛋白表达水平。结果 circ0066629在结直肠癌5-Fu及伊立替康耐药患者组织中表达下调,但在不同结直肠癌细胞系中表达上调。过表达circ0066629明显促进了5-Fu和伊立替康处理下的LOVO细胞活力。MiR-219a-2-3p被预测为circ0066629的靶基因,并且miR-219a-2-3p过表达对LOVO细胞活力的作用与circ0066629相反。另外,p53是miR219a-2-3p的预测靶向基因,p53特异性抑制剂(PFT-α)明显抑制LOVO细胞活力。结论 circ0066629通过调控miR-219a-2-3p/P53/MDM2轴促进结直肠癌细胞活力。

前沿

发现可预防心室性心肌病猝死的机制近日，来自英国牛津大学的Xin Lu研究团队发现p53抑制剂iASPP可以预防致心律失常性右心室心肌病（ARVC）诱发的猝死。