姜黄素通过调控p53/SLC7A11/GPX4通路抑制脂多糖诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化

目的:探讨姜黄素(Cur)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7源性破骨细胞的作用及其机制。方法:用LPS诱导RAW264.7细胞建立破骨细胞模型。CCK-8法检测RAW264.7细胞活力;TRAP染色鉴定破骨细胞形成;TRAP活性测定检测破骨细胞活力;生化检测细胞活性氧(ROS)、Fe^(2+)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11及GPX4蛋白水平。结果:LPS成功诱导RAW264.7细胞为破骨细胞。TRAP染色及TRAP活性结果显示,与LPS组相比,Cur组破骨细胞数量及TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01);与Con组相比,LPS+Erastin组TRAP活性显著升高(P<0.01),经Cur处理后,TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01)。生化检测结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组ROS、Fe^(2+)及MDA水平显著升高,GSH水平显著降低(P<0.01);与LPS+Erastin组相比,Cur组ROS、Fe^(2+)及MDA水平呈剂量依赖式下降(P<0.01),GSH水平呈剂量依赖式上升(P<0.01)。电镜结果显示,与LPS组比较,LPS+Erastin组细胞线粒体嵴减少,膜密度增加;经Cur处理后,细胞线粒体嵴明显增加,膜密度减小。RT-qPCR和Western blot结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组p53的mRNA和蛋白水平显著升高,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.01);经Cur处理后,p53的mRNA和蛋白水平显著降低,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:Cur可抑制LPS诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化,其机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路被抑制有关。

白藜芦醇通过激活p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡减少脑缺血再灌注损伤

目的探讨白藜芦醇对脑缺血再灌注后铁死亡的抑制作用及其机制。方法250~280 g的SPF级SD雄性大鼠63只,随机分为假手术组、脑缺血再灌注组(MCAO/R)组、白藜芦醇组。利用线栓法建立大鼠疾病模型。给药组剂量为30 mg/kg。给药28 d后应用Zea-longa评分评估大鼠神经功能。给药24 h取材大鼠脑组织,通过称重法评估脑水肿情况,应用免疫荧光染色检测谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),长链脂酰辅酶A合成酶4(long chain lipoyl coenzyme A synthetase 4,ACSL4)。试剂盒检测各组脑组织中Fe^(2+)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平。利用蛋白免疫印记(Western Blot)对不同组别的大鼠脑组织中p53、SLC7A11以及GPX4蛋白表达进行检测。结果与损伤组相比,白藜芦醇治疗组Zea-longa评分和脑组织水含量、Fe^(2+)、MDA明显降低,GSH、SOD表达明显增加;免疫荧光染色结果显示,GPX4表达明显增强、ACSL4表达降低。WB通路蛋白结果显示,白藜芦醇治疗组P53表达降低,SLC7A11表达升高。结论白藜芦醇通过调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制MCAO/R大鼠铁死亡,进而促进缺血再灌注大鼠神经功能恢复。

基于p53/SLC7A11/GPX4信号轴探讨七叶内酯诱导小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的作用机制

目的:探讨七叶内酯对小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的影响及其作用机制。方法:对七叶内酯与p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)进行分子对接,并绘制Kaplan-Meier和time ROC曲线。将4T1细胞分为对照组、1/2 IC_(50)组、IC_(50)组、2 IC_(50)组、erastin组和卡培他滨组。采用CCK-8法观察4T1细胞活力情况,筛选药物干预浓度;电镜观察4T1细胞线粒体形态,评估线粒体损伤情况;试剂盒检测4T1细胞活性氧(ROS)、Fe2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和GPX4的水平;采用划痕和Transwell小室实验检测4T1细胞侵袭和迁移能力;Western blot检测p53、SLC7A11、GPX4和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达水平。结果:与对照组相比,七叶内酯1/2 IC_(50)、IC_(50)和2 IC_(50)组细胞活力,GSH和GPX4表达水平,侵袭和迁移能力,以及SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均降低,细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴减少(P<0.05),Fe2+、ROS和MDA水平及p53和ACSL4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:七叶内酯可促进4T1细胞铁死亡,其作用机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路相关。

青蒿琥酯通过p53/SLC7A11/GPX4轴诱导人骨肉瘤细胞铁死亡

目的:探讨青蒿琥酯(Art)对骨肉瘤的促铁死亡作用及其机制。方法:将人骨肉瘤U-2 OS细胞分为4组:正常对照组、ferrostatin-1(Fer-1)组、Art组和Art+Fer-1组。CCK-8法检测细胞活力;生化方法检测细胞ROS、Fe^(2+)和GSH水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化生物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11和GPX4蛋白水平。结果:Art显著抑制了U-2 OS细胞的生长。Art通过促进Fe^(2+)的积累和ROS的形成、抑制GSH的产生,诱发了OS细胞铁死亡,而铁死亡抑制剂Fer-1则抑制了U-2 OS细胞铁死亡。此外,Art还改变了U-2 OS细胞的线粒体形态,表现为线粒体缩小,线粒体膜密度增高,线粒体嵴减少。Art抑制了铁死亡通路上SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达、上调了铁死亡上游调控因子p53的表达,从而诱导铁死亡。结论:Art能通过p53/SLC7A11/GPX4通路诱导骨肉瘤细胞铁死亡。

电离辐射对小鼠肝细胞铁死亡的影响及机制研究

目的探讨电离辐射对小鼠肝细胞铁死亡的影响及机制。方法应用随机数表法将24只C57BL/6J小鼠分成健康对照组(对照组)6只、照射组18只(全肝单次30 Gy X射线照射),分别于照射后6、24、72 h处死小鼠获取肝组织标本及血浆。采用全自动生化分析仪测定血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)含量,全自动血凝测试仪测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肝组织病理学改变,普鲁士蓝染色检测肝组织铁沉积,免疫组织化学染色检测肝四羟基壬烯醛(4HNE)、铁调素(hepcidin)表达水平,并做定量分析。根据试剂盒说明书采用酶标仪分析测定血浆丙二醛含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽含量。蛋白质印迹法检测肝转铁蛋白受体1(TfR1)、p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。结果与对照组比较,照射组照射后6、24 h小鼠血浆ALT(t=5.15、5.47,P值均<0.001)、AST含量上升(t=8.42、2.50,P值均<0.001),照射后72 h血浆PT延长(t=3.12,P=0.011),APTT缩短(t=3.26,P=0.009)。组织病理结果显示,照射后6、24、72 h肝明显水肿(t=9.58、10.09、18.70,P值均<0.001),出现不同程度的铁沉积(t=8.57、15.31、32.11,P值均<0.001),铁调素阳性细胞在照射后浸润明显增多(t=5.36、13.17、17.11,P值均<0.001),4HNE阳性细胞数明显增多(t=18.86、22.67、9.12,P值均<0.001)。同时电离辐射诱导血浆丙二醛含量显著上升(t=4.36、7.47、8.22,P值均<0.001),SOD减少(t=4.52、5.80、7.60,P值均<0.001),T-AOC减少(t=13.24、20.49、24.96,P值均<0.001),谷胱甘肽减少(t=2.78、6.07、11.25,P=0.020、<0.001、<0.001)。照射后24、72 h,铁死亡标志蛋白TfR1蛋白表达明显上调(t=3.46、5.40,P=0.026、0.006),GPX4蛋白表达下调(t=11.88、30.63,P值均<0.001);照射后6、24、72 h,p53蛋白表达显著上调并保持高水平(t=7.84、4.25、8.22,P=0.001、0.013、0.001),SLC7A11蛋白表达下调(t=9.29、19.96、9.09,P值均<0.001)。结论电离辐射诱导肝细胞发生铁死亡,且其作用机制可能与激活p53-SLC7A11-GPX4通路有关。