大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。

表达肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒重组载体的构建

目的构建携带肺孢子菌p55多表位串联基因(p55TAG)的腺病毒重组载体,鉴定其在真核细胞HEK293中的表达情况。方法将人工合成的p55TAG目的片段与腺病毒载体(p HBAd-EF1-MCS-GFP)连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,经Amp抗性筛选得到重组载体p HBAd-p55TAG,将重组载体与腺病毒骨架质粒p BHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)验证转染结果,收集包装成功的病毒进行PCR扩增,扩增产物测序验证,用Western blot检测病毒在感染细胞后的目的蛋白表达情况。结果构建的p HBAd-p55TAG腺病毒重组载体转染HEK293细胞后检测到绿色荧光蛋白表达,包装好的病毒PCR扩增产物测序结果与原始序列一致,Western blot检测结果显示在60 k Da处有成功表达目的条带。结论本研究成功构建了表达肺孢子菌p55多表位串联基因的腺病毒重组载体,并验证其能在真核细胞中有效表达。构建的载体为进一步研究抗肺孢子菌感染疫苗奠定了基础。