卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核表达质粒的构建与表达

目的构建卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。方法SD大鼠皮下注射免疫抑制剂地塞米松14周,建立卡氏肺孢子虫大鼠模型。从感染大鼠肺组织中抽提总RNA,RT-PCR克隆p55基因,测序,验证扩增产物。利用定向克隆技术将p55基因片段克隆到载体pGEX-4T-1上,重组质粒经酶切分析、PCR鉴定后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。最后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定表达产物。结果克隆的p55基因片段为690bp,重组质粒pGEX-4T-1/690构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量(Mr)约为62000,表达产量约占菌体蛋白的11.6%;Western blotting分析结果显示,表达蛋白能分别与谷胱甘肽(GST)抗体、卡氏肺孢子虫感染的大鼠血清发生反应。结论构建了卡氏肺孢子虫p55抗原基因的pGEX-4T-1/690重组质粒,诱导表达的蛋白具有良好的抗原性。

人工合成肺孢子菌p55抗原串联基因真核表达载体的构建及表达

目的研究肺孢子菌p55抗原人工合成串联基因的真核表达载体构建及其表达鉴定。方法从肺孢子菌p55蛋白5个变异体中选取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位,串联合成一段多表位基因,命名为TAG。将TAG双酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表达载体,构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,将重组质粒转染至感受态TG-1大肠杆菌中进行扩增后,经提取纯化质粒再转染至HEK293细胞,用Western blot鉴定蛋白表达水平。结果构建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒经酶切后测序鉴定,证明其序列正确,成功转染至HEK293细胞,Western blot检测其在HKE293细胞中能进行有效基因表达。结论本研究构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步阐明TAG的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究奠定基础。

卡氏肺孢子虫p55抗原片段免疫原性的研究

目的研究卡氏肺孢子虫p55基因片段重组质粒表达产物的免疫原性。方法原核表达质粒pGEX-570的表达产物融合蛋白GST-p55/570,经谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察。将33只BALB/c小鼠随机分为3组(每组8～13只),分别用GST-p55/570(50μg/只)、GST(50μg/只)和PBS免疫,每2周1次,共4次。末次免疫后7d,分离小鼠脾细胞,用噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞增殖反应;分别于免疫前和初次免疫后14、28、42和49d,采血分离血清,ELISA检测血清中GST-p55/570抗体水平。用GST-p55/570组初次免疫后49d的血清分别与GST-p55/570和GST反应,进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果表达产物GST-p55/570的相对分子质量(Mr)约为47000。MTT法结果显示,GST-p55/570组小鼠淋巴细胞的刺激指数(2.0630±0.1602)显著高于GST组(1.1345±0.0735)和PBS组(1.1248±0.0416)(P值均<0.01)。免疫后14～49d,GST-p55/570组小鼠的血清抗体水平均显著高于GST组和PBS组(P值均<0.01)。Western blotting结果显示,免疫后血清能与GST-p55/570发生特异性反应。结论融合蛋白GST-p55/570能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫。

卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。