p62-Keap1-Nrf2信号通路在减轻NOD/SCID小鼠心肺复苏后心肌损伤中的作用

目的探讨p62-Keap1-Nrf2抗氧化信号通路在严重联合免疫缺陷小鼠心脏骤停(CA)心肺复苏(CPR)后心肌缺血-再灌注(I/R)损伤过程中的作用机制.方法应用免疫功能正常的雄性C57BL/6小鼠(80只)和严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(80只)复制高钾合并窒息心脏骤停心肺复苏模型,根据复苏后取材时间点不同将两种品系小鼠分别分为复苏前组和复苏后2h组、复苏后12 h组、复苏后24 h组及复苏后48 h组.观察各组小鼠自主循环恢复率(ROSC)、自主呼吸恢复率及48 h存活率.Western blot检测不同时间点两种小鼠心肌细胞中p62-Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白的表达水平.透射电镜观察复苏后不同时间点线粒体形态.结果①两种小鼠心脏骤停心肺复苏后ROSC率和自主呼吸恢复率差异无统计学意义(P>0.05),但NOD/SCID小鼠较C57BL/6小鼠心脏骤停心肺复苏后48 h存活率明显降低(P<0.05).②与复苏前比较,C57BL/6小鼠心肌细胞p62和P-p62(Ser351)蛋白表达在复苏后2h时降低(P<0.01),复苏后12 h时升高(P<0.01),复苏后24 h和48 h时差异均无统计学意义(P>0.05),而在复苏后各时间点,NOD/SCID小鼠心肌细胞p62和P-p62(Ser351)蛋白表达呈逐渐增高趋势(P<0.叭).并且,NOD/SCID小鼠在复苏后2、24、48 h时心肌细胞中p62和P-p62(Ser351)蛋白表达均较C57BL/6小鼠明显增高(P<0.01).与复苏前比较,C57BL/6小鼠和NOD/SCID小鼠在心脏骤停心肺复苏后各时间点心肌细胞Keap1蛋白和细胞核Nrf2蛋白表达均明显增高.此外,与C57BL/6小鼠比较,NOD/SCID小鼠在复苏后各时间点心肌细胞Keap1蛋白表达均明显增高,而在复苏后2、12、48 h时NOD/SCID小鼠心肌细胞细胞核Nrf2蛋白均呈明显高表达(P<0.01).③C57BL/6小鼠在心肺复苏后心肌I/R损伤2h和12 h可见心肌组织中线粒体明显肿胀,大量自噬小体形成;而NOD/SCID小鼠在复苏后2h和12h也可见到线粒体明显肿胀,但自噬体形成却发生在复苏后24 h和复苏后48 h,并且自噬小体数目较少.结论 NOD/SCID小鼠由于存在线粒体自噬缺陷,其在心脏骤停心肺复苏后心肌I/R损伤早期并未及时启动线粒体自噬机制,机体主要通过p62-Keap1-Nrf2抗氧化信号通路来发挥保护作用.

茵陈蒿汤对重症急性胰腺炎大鼠相关急性肝损伤的作用及p62-keap1-Nrf2信号通路的影响

目的观察茵陈蒿汤对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠相关急性肝损伤的作用及p62-keap1-Nrf2信号通路的影响。方法将雄性8周龄SD大鼠30只均分为3组:假手术组、模型组和茵陈蒿汤组。模型组与茵陈蒿汤组用逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠建立SAP模型,以0.2 m L/min的均匀速度注射到胆管内。假手术组注射等量生理盐水。造模2 h后茵陈蒿汤组以5 g/kg进行灌胃,对照组和模型组给予等量生理盐水。24 h后处死大鼠后进行相关检测。结果假手术组未见病理损害,模型组和茵陈蒿汤组出现不同程度的小叶中心肝细胞坏死,肝细胞颗粒变性,炎性细胞浸润,但茵陈蒿汤组的病理损伤较模型组明显减轻。与假手术组比较,模型组和茵陈蒿汤组大鼠肝脏系数均增高、血清中血清淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(GOT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量均增高,肝组织中p62、keap1和Nrf2蛋白表达均增高;与模型组比较,茵陈蒿汤组大鼠肝脏系数降低,血清中AMY、ALT、GOT、TNF-α和IL-1β含量均降低,肝组织中p62、keap1和Nrf2蛋白表达均降低。结论茵陈蒿汤能通过抑制p62-keap1-Nrf2信号通路从而减轻SAP大鼠急性肝损伤。

干预自噬调控p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路对结直肠癌细胞铁死亡及奥沙利铂耐药的影响

目的探讨干预自噬对结直肠癌细胞铁死亡和奥沙利铂(OXA)耐药的影响及分子机制。方法培养人结直肠癌HCT-8、COLO205、HCT-116、SW620和SW480细胞系,筛选LC3表达适中的HCT-116细胞,检测其与OXA耐药HCT-116/OXA细胞株LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达差异,并应用自噬和铁死亡干预剂并联合OXA干预HCT-116/OXA细胞株,检测LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达,CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性及对OXA的敏感性,平板克隆、Transwell实验检测各组细胞的生长情况和侵袭能力。结果5组细胞中HCT-116细胞的LC3、p62和GPX4均呈中等表达量;与HCT-116细胞相比,HCT-116/OXA细胞对OXA敏感性较低,且p62、Nrf2、GPX4蛋白呈高表达,LC3和Keap1呈低表达,Fe^(2+)、GSH、MDA表达水平均增高(P<0.05);自噬激活剂Rapa组及Rapa+Fer-1组较Fer-1组和对照组的LC3、Keap1蛋白及Fe^(2+)、MDA水平均升高,而p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平呈低表达,且Rapa+Fer-1组GPX4蛋白、GSH的水平低于Rapa组(P<0.05)。在自噬抑制剂组中,CQ组及CQ+Erastin组与对照组和Erastin组相比其LC3、p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平均呈高表达,Keap1蛋白、Fe^(2+)、MDA均呈低表达,而Erastin组GPX4蛋白、GSH表达低于其余三组,Fe^(2+)、MDA含量高于其余三组(P<0.05)。自噬激活剂联合应用OXA,Rapa干预组与其余三组相比,其对OXA的化学敏感性高、迁移细胞数量少、细胞增殖活性低;Rapa+Fer-1组对OXA的敏感性低于Rapa组,但高于Fer-1组和对照组(P<0.05)。而Fer-1组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。自噬抑制剂联合应用OXA,Erastin、CQ+Erastin和CQ三组与对照组相比其细胞活性、迁移能力和克隆形成能力均降低,其中Erastin组最低,而CQ+Erastin组高于Erastin组、低于CQ组(P<0.05)。结论在结直肠癌中,自噬参与了铁死亡的调节,干预自噬可通过p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路调控结直肠癌细胞发生铁死亡,从而逆转OXA耐药。

右美托咪定调控p62/Keap1/Nrf2信号轴对LPS诱导大鼠肝脏损伤的保护机制研究

目的 探究右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)调控自噬受体蛋白p62/Kelch样ECH相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)(p62/Keap1/Nrf2)通路对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠肝脏损伤的保护作用机制。方法 选取SD大鼠50只,随机将大鼠分为5组,分别为空白对照组(Sham组)、LPS诱导肝脏损伤模型组(LPS组)、LPS诱导+Dex干预组(Dex组)、Keap1/Nrf2信号轴抑制剂组(KI696组)、LPS诱导+Dex干预+KI696组(Dex+KI696组)。统计各组大鼠干预后血清、肝功能因子,包括总胆固醇(Total cholesterol,TC)、总血脂(Total glyceride,TG)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST),肝组织炎症因子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),氧化应激指标丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)水平差异。HE染色分析各组大鼠肝脏组织病理形态;Western-blot检测各组大鼠肝脏组织p62/Keap1/Nrf2信号轴关键蛋白p62、Keap1、Nrf2,铁死亡关键蛋白前列腺素内过氧化物合酶(Prostaglandin endoperoxide synthase,PTGS2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白基因(Recombinant human ferritin heavy chain,FTH1)表达。结果 与Sham组相比,LPS组p62、TC、TG、ALT、AST、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、MDA、PTGS2表达升高,Keap1、Nrf2、SOD、GSH、CAT、GPx4、FTH1表达降低(P<0.05)。与LPS组相比,Dex组p62、TC、TG、ALT、AST、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、MDA、PTGS2表达降低,Keap1、Nrf2、SOD、GSH、CAT、GPx4、FTH1表达升高(P<0.05);KI696组Keap1、PTGS2、SOD、GSH、CAT、GPx4、FTH1表达降低,Nrf2、TC、TG、ALT、AST、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、MDA表达升高(P<0.05)。与KI696组相比,Dex+KI696组Keap1、PTGS2、SOD、GSH、CAT、GPx4、FTH1表达升高(P<0.05)。结论 右美托咪定通过抑制p62活性,激活Keap1/Nrf2通路活性发挥抗氧化应激损伤、抗炎症反应作用,减缓铁死亡程度,达到保护肝组织的作用。

对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤中p62-keap1-Nrf2信号通路变化

目的检测对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导小鼠急性肝损伤中p62-keap1-Nrf2抗氧化信号通路变化。方法 40只C57/BL6小鼠建立急性肝损伤剂量-反应模型,随机分为4组:对照组、APAP低剂量组(180 mg/kg)、APAP中剂量组(300 mg/kg)和APAP高剂量组(500 mg/kg),每组10只。禁食12 h后,腹腔注射0.9%氯化钠溶液或APAP溶液,24 h后摘眼球取血。另取60只小鼠建立时间-反应模型,对照组给0.9%氯化钠溶液,染毒组腹腔注射300 mg/kg APAP后,分别于3、6、12、24和48 h各取10只小鼠摘眼球取血测生化指标。以上小鼠均剪取肝同一部位做病理切片,HE染色检测病理损伤。并匀浆肝组织提取蛋白,利用Western blot检测p62-keap1-Nrf2信号通路相关蛋白的表达水平,荧光定量PCR技术检测抗氧化基因的相对表达。结果剂量-反应模型中,APAP处理组与对照组相比,肝脏系数明显增大(P<0.05);ALT、AST水平显著升高(P<0.05);肝病理切片显示APAP处理组出现不同程度肝细胞坏死;p62-keap1-Nrf2通路相关蛋白p62、p-p62、Keap1、Nrf2胞浆及胞核蛋白表达增加;而抗氧化基因HO-1、GCLC相对表达量下降。时间-反应模型中,APAP处理组小鼠ALT、AST水平明显高于对照组,呈时间反应趋势,24 h达到峰值;抗氧化基因HO-1、GCLC在3和6 h表达明显增加(P<0.05),12、24和48 h急剧下降至较低水平。结论对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤中,p62-keap1-Nrf2信号通路激活,Nrf2可能在APAP肝损伤早期通过激活抗氧化相关基因表达发挥作用。

基于Keap1/Nrf2/NLRP3炎症小体和p62途径探讨右美托咪定改善脑卒中后损伤的内在机制

目的:探讨右美托咪定(Dex)对脑卒中后模型脑损伤的改善作用,并基于Keap1/Nrf2/NLRP3炎症小体和p62途径探讨其作用机制。方法:大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、Dex组,除假手术组外,各组采用线栓法制造缺血性脑卒中大鼠模型,假手术组只穿线不结扎。造模成功后,依达拉奉组大鼠给予依达拉奉3.2 mg/kg,Dex组大鼠灌胃给予Dex 50 mg/kg,模型组、假手术组大鼠给予等体积生理盐水,连续给药14 d。采用改良m-NSS法评价大鼠行为学变化;TTC染色测定脑梗死体积;ELISA检测脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;免疫荧光染色检测脑组织内ROS含量;RT-PCR检测脑组织Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA水平;Western blot检测Keap1、Nrf2、NLRP3、p62蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠脑神经功能评分明显升高,脑梗死体积明显增大(P<0.01),脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及ROS水平明显升高(P<0.01),Keap1、Nrf2、NLRP3、p62 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组相比,Dex组大鼠脑神经功能评分明显降低,脑梗死体积明显减小(P<0.01),脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及ROS水平明显降低(P<0.01),NLRP3、p62 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01),Keap1、Nrf2 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01)。结论:Dex可明显改善脑卒中大鼠脑损伤,其可能是通过调控Keap1、Nrf2、NLRP3炎症小体及p62相关基因及蛋白表达实现的。

miR-141-3p通过调节Keap1-NRF2/ARE信号通路对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺纤维化的影响

目的 探讨miR-141-3p对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺纤维化的影响及作用机制。方法 将大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、agomir-NC组、miR-141-3p agomir组,每组10只;除对照组外,其余大鼠采用脂多糖(LPS)滴注法构建ARDS模型;将大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN细胞分为NC组、LPS组、miR-NC组、miR-141-3p mimics组、miR-141-3p mimics+pcDNA组、miR-141-3p mimics+NRF2与Kelch样环相关蛋白1(Keap1)组,除NC组外,其余各组建立LPS细胞模型;qPCR检测肺组织和细胞中miR-141-3p、Keap1 mRNA表达;Western blot检测肺组织和细胞上皮型钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙黏附素(N-cadherin)、微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、自噬相关基因Beclin-1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Keap1、核因子E2相关因子2(NRF2)、血红素氧合酶1(HO-1)表达;HE和Masson染色观察肺组织病理变化并进行肺损伤评分和肺纤维化面积评分;试剂盒检测肺组织羟脯氨酸(Hyp);酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;双萤光素酶报告实验验证miR-141-3p与Keap1靶向关系。结果ARDS大鼠肺组织和细胞中miR-141-3p表达下调,Keap1表达上调(P<0.05);过表达miR-141-3p可降低大鼠肺组织病理损伤和纤维化程度、Hyp含量,上调肺组织和细胞中SOD、E-cadherin、LC3B、Beclin-1、NRF2、HO-1表达,下调IL-1β、TNF-α、MDA、N-cadherin、α-SMA、Col-Ⅰ、Keap1表达(P<0.05);过表达Keap1可逆转过表达miR-141-3p对ARDS大鼠肺泡上皮细胞损伤的改善作用(P<0.05);双萤光素酶报告基因实验证实miR-141-3p与Keap1可能存在靶向调控关系。结论 过表达miR-141-3p可能激活Keap1-NRF2/ARE信号通路,激活自噬,抑制炎症反应、氧化应激和上皮-间充质转化进展,改善ARDS大鼠肺纤维化。

亚慢性铝暴露致大鼠认知障碍的Sirt1-Keap1/Nrf2信号通路机制

目的:观察亚慢性铝暴露对大鼠海马沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor2,Nrf2)和微小RNA-128-3p(miR-128-3p)表达水平的影响,探讨miR-128-3p和Sirt1-Keap1/Nrf2信号通路在铝致大鼠认知障碍中的机制。方法:选取32只6周龄SPF级健康雄性SD大鼠,体重(190±20)g,按体质量随机分为4组:对照组、低剂量(10μmol/kg)组、中剂量(20μmol/kg)组和高剂量(40μmol/kg)组,每组8只。腹腔注射麦芽酚铝建立大鼠染毒模型。染毒结束后,Morris水迷宫实验来检验大鼠的学习记忆能力,Western blot检测大鼠海马组织中Sirt1、Keap1和Nrf2蛋白的表达,RT-qPCR检测海马组织miR-128-3p的表达,冰冻切片荧光染色检测大脑皮层活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果:(1)在定位巡航实验中,第3、4和5天铝暴露组大鼠的逃避潜伏期均显著高于对照组(P<0.05)。第6天,高剂量组与对照组和低剂量组相比穿越平台和平台象限的次数均减少(P<0.01)。(2)各组大鼠海马组织中Sirt1和Nrf2的相对表达水平随着麦芽酚铝暴露剂量的增加逐渐降低;Keap1的相对表达水平随着麦芽酚铝暴露剂量的增加逐渐升高,且高剂量组中miR-128-3p相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)。(3)随着染毒剂量的增加,大鼠海马中谷胱甘肽过氧化物酶的含量逐渐减少,ROS水平逐渐升高。结论:亚慢性铝暴露可激活大鼠海马中miR-128-3p的表达,抑制Sirt1-Keap1/Nrf2通路,使Sirt1-Keap1/Nrf2通路不能被激活发挥抗氧化能力,大鼠的抗氧化系统失衡,导致大鼠神经细胞氧化损伤,表现为大鼠的认知功能降低。

自噬受体蛋白p62与Keap1-Nrf2信号通路在肿瘤中的研究进展

自噬和Keap1-Nrf2信号通路是抵抗细胞代谢和氧化应激的两个主要细胞防御机制。该两个机制通过p62-Keap1-Nrf2通路中自噬受体蛋白p62/SQSTM1的磷酸化相关联。p62-Keap1-Nrf2通路在正常细胞中起保护作用,然而,该通路也诱导肿瘤发生,并且通过由Nrf2激活介导的代谢改变促进肿瘤细胞的生长和耐药。该文就p62与Keap1-Nrf2信号通路在肿瘤中的研究进展作一综述,以期为临床疾病诊治带来新视角。

选择性自噬接头蛋白p62与Keap1-Nrf2信号通路在神经退行性疾病中的研究进展

在自噬小体形成的过程中,选择性自噬接头蛋白p62作为连接自噬相关蛋白、LC3、聚泛素化蛋白之间的桥梁,通过泛素信号途径将受损的蛋白质、线粒体及入侵的细菌转运到自噬小体中并降解。p62作为一种自噬衔接蛋白将自噬和Keap1-Nrf2通路相关联。p62可竞争性结合Keap1,通过自噬途径将其清除,促使Nrf2解离入核,Nrf2结合到下游抗氧化元件p62启动子区又可促进p62的生成,形成正性反馈环路。神经退行性疾病病因复杂、发病机制尚不清楚,自噬失调以p62调控的非经典途径激活Keap1-Nrf2信号通路成为该领域研究热点。

CHMP2B高表达促进胰腺癌发生和发展的机制

目的解析带电多泡体蛋白2B(CHMP2B)在胰腺癌中高表达的临床意义,探究CHMP2B在胰腺癌中的促癌机制。方法通过GEPIA网站的转录组学分析胰腺癌中CHMP2B的表达情况,探究CHMP2B的表达与胰腺癌无疾病生存率和总生存率的关系。通过Western blot法检测HPNE细胞与BXPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1三种胰腺癌细胞中CHMP2B的表达。胰腺癌在MIA PaCa-2细胞中使用Lipofectamine 2000转染CHMP2B因子的过表达质粒,通过Western blot验证在MIA PaCa-2中过表达CHMP2B质粒的过表达效果。通过克隆形成实验比较过表达CHMP2B因子对MIA PaCa-2细胞成瘤能力。CCK-8实验和Transwell实验验证过表达CHMP2B因子对MIA PaCa-2细胞增殖和迁移侵袭的影响。采用免疫荧光染色检测CHMP2B因子的细胞定位,Western blot法检测CHMP2B高表达对微管关联蛋白1轻链3B(MAP1LC3B)和重组核孔蛋白62(P62)表达的影响。结果CHMP2B因子在胰腺癌组织中表达升高(P<0.01)。CHMP2B因子的过表达降低胰腺癌患者的总生存率和无疾病生存率(P<0.01)。人胰腺癌细胞系中CHMP2B表达量明显高于正常人胰腺导管上皮细胞。CHMP2B的高表达促进胰腺癌MIA PaCa-2细胞成瘤,同时与对照组相比CHMP2B高表达导致胰腺癌增殖、迁移和侵袭能力升高。免疫荧光染色可见CHMP2B在细胞核和细胞质中均有分布,并与膜泡分泌相关。CHMP2B的高表达促进了MAP1LC3B的表达,但是抑制了P62的表达。结论临床胰腺癌组织样本中CHMP2B的高表达与体外胰腺癌细胞系中的高表达相一致。CHMP2B分布在细胞核和细胞质,并且参与膜泡运输和溶酶体自噬,在胰腺癌细胞系MIA PaCa-2中,CHMP2B与自噬标志物MAP1LC3B表达呈正相关,并且抑制P62的表达。可知CHMP2B对胰腺癌恶性程度的促进与细胞自噬相关。CHMP2B通过调节膜泡运输和细胞自噬满足胰腺癌细胞高的营养代谢需求,进而促进胰腺癌的恶性生物学行为。

H_6P_2W_(18)O_(62)/SiO_2催化合成5-乙氧羰基-4-(4-羟基苯基)-6-甲基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮

采用H6P2W18O62/SiO2为催化剂,以对羟基苯甲醛、乙酰乙酸乙酯、尿素为原料合成5-乙氧羰基-4-(4-羟基苯基)-6-甲基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮.探讨H6P2W18O62/SiO2对本反应的催化活性,较系统地研究了反应物物质的量比、催化剂用量、反应时间、反应温度四因素对产物收率的影响.实验表明:H6P2W18O62/SiO2是合成5-乙氧羰基-4-(4-羟基苯基)-6-甲基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮的良好催化剂;在n(对羟基苯甲醛)∶n(乙酰乙酸乙酯)∶n(尿素)=1∶1.5∶1.5,催化剂的用量占反应物料总质量的1.5%,反应温度为80℃,反应时间为60 min的最佳条件下,其收率可达94.4%.

肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2/p62的研究进展

肿瘤细胞耐药性是导致化疗失败及愈后不良的重要原因。在肿瘤治疗中,化疗药物作用于肿瘤细胞,Keapl/Nrf2通路上调,Nrf2及其介导的下游二相抗毒酶表达增高,是导致肿瘤细胞耐药性升高的重要机制。近年来有报道认为自噬通过促进肿瘤细胞产生凋亡抵抗从而产生耐药性。p62参与调节Keapl/Nrf2通路,影响了Keapl的基础水平和Nrf2的基本活性,对肿瘤细胞耐药都具有重要意义。本文对肿瘤细胞耐药性与p62/Keapl/Nrf2通路的相互作用和分子机制进行综述。

艳山姜挥发油调控p62/Keap1/Nrf2信号改善糖尿病小鼠胰腺损伤

目的探讨艳山姜挥发油(essential oils from Fructus Alpiniae zerumbet,EOFAZ)对2型糖尿病小鼠胰腺损伤的保护作用及作用机制。方法高糖高脂(HFS)饲料饲养C57 BL/6小鼠形成胰岛素抵抗,腹腔注射链脲佐菌素(STZ,120 mg·kg^(-1))建立2型糖尿病小鼠模型,将糖尿病小鼠随机分成糖尿病组(DM)、DM+EOFAZ低剂量组(90 mg·kg^(-1))、DM+EOFA高剂量组(180 mg·kg^(-1))、DM+二甲双胍组(250 mg·kg^(-1)),另取健康小鼠随机分为正常对照组、EOFAZ毒性组(180 mg·kg^(-1))。EOFAZ组、二甲双胍组分别灌胃EOFAZ和二甲双胍的同时,正常组和DM组以等体积生理盐水灌胃,每日一次,连续灌胃8周后,血糖仪检测血糖。采用HE染色对胰腺进行病理形态学观察;蛋白免疫印迹法分析胰腺组织中p62、Keap1、Nrf2、HO-1、Bcl-2及Bax的表达。免疫组织化学分析胰腺组织中Nrf2的表达水平。结果与模型组相比较,给予EOFAZ后,可明显改善胰岛的病理形态;明显下调Keap1、Bax蛋白表达,并上调p62、Nrf2、Ho-1及Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)。结论EOFAZ对糖尿病诱导的胰腺损伤具有明显的改善作用,其作用可能与激活p62/Keap1/Nrf2信号通路,抑制凋亡信号相关。

Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬调节作用的研究进展

自噬(autophagy)是利用溶酶体对细胞自身成分如细胞器等进行降解的过程。细胞自噬是一个连续动态发展的过程,首先细胞内膜包裹形成自噬囊泡,囊泡相互融合形成自噬小体,紧接着自噬小体与溶酶体融合,形成自噬溶酶体,最后包裹内容物被溶酶体降解。细胞自噬对维持细胞内环境的稳态和生存尤为重要。在应激状态时,机体会诱导自噬,同时激活体内抗应激防御体系来对应激做出响应,从而保持稳态。研究表明,Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体对机体应激状态的调节具有重要作用,而细胞自噬的调节机制复杂多样,其受多个重要信号转导通路和关键分子的调控。本文主要从Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬的调节方面进行探讨,旨在为研究自噬调控机制和药物开发与治疗提供参考。

miR-34a-5p通过调节Nrf2-Keap1信号通路介导年龄相关性白内障氧化应激的实验研究

目的探讨miR-34a-5p通过调节Nrf2-Keap1信号通路介导年龄相关性白内障的氧化应激。方法检测年龄相关性白内障患者和正常透明晶状体前囊组织及人晶状体上皮细胞氧化应激模型中miR-34a-5p和预测靶基因Nrf2表达及人晶状体上皮细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性。将miR-34a-5p模拟物、模拟物对照、miR-34a-5p抑制剂和抑制剂对照分别转染人晶状体上皮细胞,然后用400μmol·L^-1 H2O2作用8 h后检测miR-34a-5p、Nrf2 mRNA和Nrf2蛋白表达,并检测人晶状体上皮细胞增殖活性。结果正常晶状体前囊组织中miR-34a-5p的相对表达量为1.03±0.29,Nrf2 mRNA的相对表达量为1.31±0.39;年龄相关性白内障组织中miR-34a-5p的相对表达量为2.69±0.99,Nrf2 mRNA的相对表达量为0.64±0.25。与正常组织相比,年龄相关性白内障晶状体组织中miR-34a-5p表达显著升高,Nrf2表达显著降低。Nrf2蛋白在年龄相关性白内障晶状体组织中表达也显著降低(均为P<0.001)。在人晶状体上皮细胞氧化应激模型中,miR-34a-5p表达显著升高,靶基因Nrf2表达显著降低,内源性ROS水平显著升高(均为P<0.001)。miR-34a-5p模拟物转染人晶状体上皮细胞后,miR-34a-5p表达显著升高,Nrf2表达显著降低,内源性ROS水平显著升高,细胞增殖活性显著降低(均为P<0.001),然而,miR-34a-5p抑制剂转染人晶状体上皮细胞后,miR-34a-5p表达显著降低,Nrf2表达显著升高,内源性ROS水平显著降低,细胞增殖活性显著升高(均为P<0.001)。双荧光素酶报告分析证实,Nrf2是miR-34a-5p的直接靶点。结论 MiR-34a-5p通过调节Nrf2-Keap1信号通路增加晶状体上皮细胞氧化应激,抑制晶状体上皮细胞的增殖,从而参与年龄相关性白内障的发生发展过程。

自噬与p62/SQSTM1在肝缺血再灌注中的作用

自噬是溶酶体依赖性的降解系统,p62作为重要的蛋白载体,可促进受损蛋白经蛋白酶体和自噬体清除。p62在线粒体自噬等选择性自噬中发挥重要作用。p62与Keap1结合并通过自噬清除Keap1,这导致游离的Nrf2水平增加,而Nrf2又可促进p62表达。因此自噬、p62、Nrf2三者间存在密切的联系,相互调控。同时,Nrf2还可促进谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和硫氧还蛋白(Thioredoxin,TXN)等多种分子的表达,而在肝缺血再灌注损伤过程中,肝细胞内这些分子可能参与细胞死亡的过程。因此,自噬与p62在肝缺血再灌注中的具体机制仍需进一步研究明确。

黄芪甲苷调控p62-Nrf2通路对抗小鼠淋巴细胞白血病耐药株的机制研究

[目的]基于p62-核因子红细胞样2相关因子2(Nrf2)通路探讨黄芪甲苷(ASTⅣ)对抗小鼠淋巴细胞白血病耐药株的机制。[方法]复制白血病细胞耐药模型,将细胞分为6组,即空白组(blank)、模型组(model)、黄芪甲苷组(ASTⅣ)、盐酸维拉帕米(VER)、Nrf2通路抑制剂(ML385)组及抑制剂与黄芪甲苷组(ML385+ASTⅣ),药物干预48 h。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测耐药细胞对顺铂的敏感性,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)变化,明确ASTⅣ对耐药细胞的影响;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率变化,荧光实时定量聚合酶链式反应(Real time PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)检测p62-Nrf2通路p62、Nrf2、血红素氧化酶-1(HO-1)、B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)及半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)等表达变化明析ASTⅣ对耐药细胞的作用机制。[结果]ASTⅣ通过下调p62-Nrf2通路节点基因p62、HO-1、bcl-2/bax,上调Caspase-3的表达量,降低耐药细胞ROS水平,增加其对顺铂敏感性,使其增殖受抑,细胞周期呈现DNA合成期(S)、合成后期(G2)/有丝分裂期(M)阻滞,凋亡率升高。[结论]ASTⅣ具有逆转白血病耐药的功效,可能与p62-Nrf2通路调控相关,但细胞最终命运受多条通路共同调控仍需探讨。

自噬受体蛋白p62的表达及功能研究

目的:构建人自噬受体蛋白p62的真核表达质粒,初步探索p62在氧化应激中的功能。方法:从HeLa细胞系中扩增SQSTM1基因,插入真核表达载体nFLAG/pRK5,构建p62的重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5。采用HEK293T细胞表达带有FLAG标签的重组p62蛋白,免疫共沉淀法观察p62和核因子E2相关因子2(Nrf2)相互作用。结果:重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5经琼脂糖凝胶电泳和测序对比均与预期结果一致,Western blot实验中p62蛋白可正常表达,且大小与预期结果一致。免疫共沉淀和蛋白质谱证明p62与氧化应激转录调控蛋白Nrf2可相互作用。结论:采用真核表达系统成功表达p62蛋白,并发现其与Nrf2可相互作用,为进一步研究p62与Keap1-Nrf2通路关系提供依据。

氯吡格雷对不同CYP2C19基因分型脑梗死患者的影响

目的观察氯吡格雷对不同CYP2C19基因分型脑梗死患者血小板CD62P、PAC-1表达和NIHSS评分的影响。方法 56例脑梗死患者根据CYP2C19基因分型分成3组,经氯吡格雷治疗14d,比较3组患者治疗前,治疗后7d、14d的血小板CD62P、PAC-1表达和NIHSS评分的改变。结果 3组患者治疗前血小板CD62P、PAC-1表达和NIHSS评分比较无统计学差异;治疗7d后EM组,IM组的CD62P、PAC-1和NIHSS评分均显著低于治疗前(P<0.05),PM组CD62P、PAC-1和NIHSS评分均低于治疗前,但差异无统计学意义(P>0.05);治疗14d后,EM组和IM组的CD62P、PAC-1和NIHSS评分均显著低于治疗前(P<0.05),也低于治疗后7d(P<0.05),PM组的CD62P、PAC-1和NIHSS评分低于治疗前(P<0.05),也低于后7d,但差异无统计学意义(P>0.05);用药第7天和用药第14天PM组的CD62P、PAC-1表达水平和NIHSS评分均高于EM组(P<0.05)。结论脑梗死患者CYP2C19基因形态可能是影响氯吡格雷临床预后的重要影响因素。