p66^(Shc)基因调控早期胚胎发育阻滞的研究进展

在胚胎早期发育过程中,存在易停留在某个阶段的现象,称之为发育阻滞,如小鼠胚胎的2-细胞阻滞等。从分子结构及功能、调控活性氧水平和作用网络方面,综述了p66Shc基因调控早期胚胎发育阻滞的研究进展,以期对该领域的研究提供借鉴。

p66^(Shc)基因敲除对小鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用

目的探讨p66Shc基因敲除对小鼠缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)的保护作用及可能的机理。方法将C57小鼠分为假手术组(野生型,sham operation,SO)、HIBI野生型组(hypoxic-ischemic wild type,HIWT)和HIBI-p66Shc基因敲除组(hypoxic-ischemic knock-out,HIKO),每组20只。采用右侧颈总动脉结扎-浸入低氧环境的方法制备小鼠HIBI模型。随后对各组小鼠神经功能障碍情况、HIBI损伤灶体积、血清神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)水平和脑组织匀浆中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平进行测量和比对。结果 HIBI造模24 h后,HIKO组小鼠的神经功能缺损程度评分(1.87±0.30)低于HIWT组小鼠(2.49±0.26),HIKO组小鼠脑梗死灶体积[(22.66±4.20)mm3]小于HIWT组小鼠[(27.31±3.23)mm3],HIKO组小鼠血清NSE含量[(8.97±0.74)ng/ml]显著低于HIWT组小鼠[(11.26±0.68)ng/ml],HIKO组小鼠脑组织IL-1β含量[(1.72±0.30)ng/ml]显著低于HIWT组小鼠[(2.07±0.28)ng/ml],P均<0.05。结论 p66Shc基因敲除可通过降低小鼠HIBI发生后脑组织IL-1β的表达,起到脑保护作用。

p66^(Shc)基因在人类长寿方面的研究进展

p66Shc基因作为新发现的长寿基因在人类衰老及生命过程中影响着人类健康。p66Shc基因编码的是磷酸化酪氨酸信号适配蛋白,敲除p66Shc基因的小鼠寿命可延长30%。p66Shc基因是活性氧族水平及与年龄相关的器官功能失调的重要调节因子。目前氧化应激过程参与人类疾病(高血脂、糖尿病、心血管疾病等)的发生发展过程已得到广泛认可。因此对于p66Shc基因的深入研究,可研制出相关靶向治疗药物,阻止或治愈与年龄相关疾病的发生。

在A549细胞中靶向p66^(Shc)shRNA的沉默效应

目的:在人非小细胞肺癌细胞A549细胞中探讨shRNA靶向慢病毒对信号衔接蛋白p66Shc的沉默效应,以更好地研究p66Shc的功能。方法:半定量RT-PCR和Western blot检测p66Shc下调后的变化情况,BrdU标记实验检测细胞的增殖变化情况。结果:在A549细胞中,运用p66Shc-shRNA干扰可以实现p66Shc在mRNA和蛋白水平的下调作用,同时发现A549细胞的增殖显著降低。结论:经过慢病毒载体介导的p66Shc-shRNA在人非小细胞肺癌A549中可获得高效转染效果,并能产生特异性的基因沉默效应,而且对细胞的增殖有显著的抑制作用,为进一步研究p66Shc功能提供了实验手段。

p66^(Shc)对亚砷酸钠诱导心肌细胞氧化应激的影响

目的探讨p66^(Shc)在亚砷酸钠介导的心肌细胞氧化应激中的作用。方法利用亚砷酸钠诱导的H9C2心肌细胞氧化应激模型,分别用CCK-8比色法检测细胞活力;双氯荧光素探针检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测p66^(Shc)、磷酸化p66^(Shc)的表达变化;免疫荧光共聚焦检测p66^(Shc)的亚细胞定位。结果与对照组相比,5μM亚砷酸钠处理组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高(P<0.001);砷引起了p66^(Shc)表达量增加,而且磷酸化p66^(Shc)与p66^(Shc)蛋白总量的比值也显著升高(P<0.05),p66^(Shc)在砷刺激下从细胞浆向线粒体转位。过表达野生型p66^(Shc)质粒增加砷介导的心肌细胞内ROS水平,而过表达突变型p66^(Shc)质粒和敲低p66^(Shc)的表达都降低砷处理组细胞内ROS水平。结论研究显示亚砷酸钠可能通过上调p66^(Shc)的表达和磷酸化水平诱导心肌细胞ROS水平的升高。

基于报告基因能筛选下调p66^(shc)基因转录的药物普筛系统的建立

将p66shc基因的启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,然后将重组质粒pGL3B-neo-p66shc转染入人的肺癌细胞A549中,通过单集落分离法得到含有重组质粒的稳定细胞系A549/p66shc。利用这个以报告基因为基础的药物普筛系统,筛选了数百种中药提取物及单体化合物,发现抑制率达到50%以上的2种中药提取物和8种单体化合物。

衰老蛋白p66^(Shc)在成年小鼠心肌组织修复中的研究

本研究组前期研究显示衰老蛋白p66^(Shc)在新生小鼠心肌再生的过程中发挥着重要的作用,p66^(Shc)缺失会导致新生小鼠受损心肌再生能力减弱。本文旨在探讨p66^(Shc)蛋白在成年小鼠心肌梗死(简称心梗)后心肌损伤修复中的作用,以期为心梗后心肌损伤治疗提供新的靶点。通过前降支结扎手术构建成年野生型(WT)和p66^(Shc)敲除(KO)小鼠心梗模型,比较分析两种小鼠心梗术后的生存率和心重体重比,用Masson染色检测受损心肌瘢痕化面积,用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色测定小鼠心梗后心肌细胞面积,用TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡程度,用Western blotting检测心肌肥厚常用标志物脑利尿钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)的表达变化。结果显示,与野生型小鼠相比,p66^(Shc)KO小鼠心梗术后的生存率、心肌瘢痕化面积、心肌细胞凋亡、心重体重比无显著差异,而BNP蛋白表达水平下调。以上结果提示,与新生小鼠不同,衰老蛋白p66^(Shc)的缺失对成年小鼠心梗后心肌损伤修复没有显著作用。

细胞复制衰老与H_2O_2诱导细胞早衰过程中P66^(SHC)基因表达谱及组蛋白修饰研究

目的研究细胞复制衰老与H2O2诱导细胞早衰过程中P66SHC基因表达变化及复制衰老过程中组蛋白修饰改变。方法人胚肺成纤维细胞固定传代直至停止增殖以制备复制衰老模型,过氧化氢诱导细胞早衰模型。采用Q-PCR方法动态观察细胞复制衰老与早衰过程中P66SHC以及组蛋白乙酰化酶EP300和去乙酰化酶HDAC1的基因表达,采用染色质免疫沉淀技术观察年轻细胞与衰老细胞P66SHC基因启动子区的组蛋白修饰情况。结果 P66SHCmRNA表达与染毒剂量正相关(R=0.909,P=0.000),EP300表达与染毒剂量负相关(R=-0.922,P=0.000),HDAC1与染毒剂量不相关(R=-0.066,P=0.839)。P66SHC表达与群体倍增代数正相关(R=0.743,P=0.006),EP300表达和HDAC1表达与群体倍增代数负相关(R=-0.709,P=0.010;R=-0.599,P=0.040)。与复制衰老组相比,早衰组细胞P66SHC、EP300及HDAC1的基因表达量均有显著性差异(t=-19.733,P=0.000;t=11.103,P=0.000;t=9.728,P=0.001)。老年细胞的P66SHC基因调控区的H3组蛋白修饰丰度均降低;在转录起始点上游3.0kb处抑制基因转录的H3K9-tri-Me修饰几乎为零,选择启动子(转录起始点下游3.8kb)处的组蛋白修饰以活化转录的修饰为主。结论 P66SHC、EP300和HDAC1均可能参与细胞衰老和氧化应激诱导的细胞早衰,早衰组细胞P66SHC基因表达与复制衰老组不同;组蛋白修饰参与P66SHC的基因表达调控。

Shc相关磷酸化酪氨酸适配蛋白在大鼠血管衰老中的调控作用

目的探讨Shc相关磷酸化酪氨酸适配蛋白p66^shc 在血管衰老表达的变化，对阐明血管衰老对动脉粥样硬化的诊治具有重要意义。方法将Wistar大鼠分为4、10、16、24月龄组，测定各组血浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，同时采用恒速注入流体方法测定大鼠颈动脉血管的顺应性，并利用蛋白免疫印迹法分析各组p66^shc、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3水平。结果随增龄，大鼠主动脉管壁增厚，纤维化程度增高，MDA浓度明显升高（与4月龄和10月龄相比，均P〈0．01），SOD浓度明显降低（与4月龄相比，均P〈0．01；与10月龄相比，均P〈0．05），颈动脉血管的顺应性增高、弹性速率和弹性面积的差异有统计学意义（与4月龄相比，均P〈0．01；与10月龄相比，均P〈0．05），p66^shc、Caspase．3蛋白表达呈时间依赖性上调。结论血管衰老性重塑的分子机制之一可能与上调p66^shc、Caspase-3蛋白的表达有关，进一步阐明其调控机制可为延缓血管衰老、防治动脉硬化提供理论依据。

Shc相关磷酸化酪氨酸适配蛋白在衰老过程中的调控作用

衰老相关的氧化应激理论和自由基理论能部分地解释衰老过程而被越来越广泛地接受。p66Shc(66-kilodalton isoform of Shcgene products)基因编码是一种磷酸化酪氨酸信号适配蛋白,敲除p66Shc基因的小鼠模型寿命可延长30%,并表现出对氧化应激的抗性。氧化应激时,p66Shc的Ser36位点被磷酸化,进而致叉头转录因子(forkhead-type transcription factors,FKHR)失活,而FKHR可调节胞内抗氧化基因的表达。p66Shc信号转导与进化上保守的寿命相关信号转导有直接联系。Shc(Src homologue and collagen protein)基本不表达于成人脑和脊髓的成熟神经元中。然而,在神经系统中存在两种Shc同源基因,Sck/ShcB和N-Shc/ShcC;并有证据表明它们在氧化应激和脑的衰老中发挥作用。Shc相关基因的表达在老化过程中受到影响,这可能与衰老时的细胞功能障碍、应激反应和/或认知功能退化有关。

线粒体呼吸链与活性氧

已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过四步单电子还原生成水。但同时也有1%-2%的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生成超氧(O_2^-·)和过氧化氢(H_2O_2)作为呼吸作用的正常代谢产物。此种来源于线粒体呼吸链的O_2^-·和H_2O_2不但在多种病理的氧化损伤中起关键作用,同样它们也是正常生理条件下对多种细胞过程具有基本调控意义的氧还信号。基于Chance实验室约自20世纪70到90年代的早期研究贡献以及20世纪90年代后其他各实验室的研究新进展,我们聚焦于下述四个相关问题的评述和讨论:(1)由于线粒体内膜面积及其含有的呼吸链复合体酶活力远远高出细胞中所有膜系数量和相关酶活力之总和,因而线粒体呼吸链产生的O_2^-·和H_2O_2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源;(2)线粒体呼吸链复合体Ⅲ的Q循环中Q_0位点中半醌自由基(UQH·)已明确是O_2^-·的单电子来源;还原细胞色素C-P66^(SHC)是生成H_2O_2的双电子供体。虽然复合体Ⅰ也是产生线粒体基质内O_2^-·的主要来源,但由于其确切生成位点尚未明确,在in vivo条件下能否产生大量O_2^-·也尚有争议;(3)线粒体呼吸链产生O_2^-·后的分配和跨膜转移涉及其生理病理作用机制和作用靶点等复杂而重要的问题,直到目前尚未意见一致。"质子和O_2^-·循环双回路解偶联模型"整合了目前提出的几种假说的联系点,指出H^+和O_2^-·相互作用生成HO_2·及其跨膜很可能是这一复杂问题的中心环节,并与O_2^-·对"脂肪酸shuttling model"或O_2^-·对"UCPS激活"模型形成了内在的联系;(4)线粒体呼吸形成的ΔP(ΔΨ和ΔpH)能直接控制呼吸链的ROS生成,并以非线性(非欧姆)相关方式通过影响Q循环中的Q_0半醌的氧还态和寿命来调节O_2^-·生成的急速变化,这一发现目前已获多家实验室的证实,业已成为线粒体学界的广泛共识。这样,线粒体呼吸生成的ΔP,除了在ATP合成和离子跨膜转运的经典的生物能量转换中介功能之外,又具有了调控作为细胞氧还信号分子ROS的新功能。线粒体也已不再单纯是细胞的"动力站",业已成为联结线粒体动态结构和功能变化与调节不同细胞事件的多细胞信号级联反应的整合平台。