p66^(Shc)基因敲除对小鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用

目的探讨p66Shc基因敲除对小鼠缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)的保护作用及可能的机理。方法将C57小鼠分为假手术组(野生型,sham operation,SO)、HIBI野生型组(hypoxic-ischemic wild type,HIWT)和HIBI-p66Shc基因敲除组(hypoxic-ischemic knock-out,HIKO),每组20只。采用右侧颈总动脉结扎-浸入低氧环境的方法制备小鼠HIBI模型。随后对各组小鼠神经功能障碍情况、HIBI损伤灶体积、血清神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)水平和脑组织匀浆中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平进行测量和比对。结果 HIBI造模24 h后,HIKO组小鼠的神经功能缺损程度评分(1.87±0.30)低于HIWT组小鼠(2.49±0.26),HIKO组小鼠脑梗死灶体积[(22.66±4.20)mm3]小于HIWT组小鼠[(27.31±3.23)mm3],HIKO组小鼠血清NSE含量[(8.97±0.74)ng/ml]显著低于HIWT组小鼠[(11.26±0.68)ng/ml],HIKO组小鼠脑组织IL-1β含量[(1.72±0.30)ng/ml]显著低于HIWT组小鼠[(2.07±0.28)ng/ml],P均<0.05。结论 p66Shc基因敲除可通过降低小鼠HIBI发生后脑组织IL-1β的表达,起到脑保护作用。

p66^(Shc)基因调控早期胚胎发育阻滞的研究进展

在胚胎早期发育过程中,存在易停留在某个阶段的现象,称之为发育阻滞,如小鼠胚胎的2-细胞阻滞等。从分子结构及功能、调控活性氧水平和作用网络方面,综述了p66Shc基因调控早期胚胎发育阻滞的研究进展,以期对该领域的研究提供借鉴。

p66^(Shc)基因在人类长寿方面的研究进展

p66Shc基因作为新发现的长寿基因在人类衰老及生命过程中影响着人类健康。p66Shc基因编码的是磷酸化酪氨酸信号适配蛋白,敲除p66Shc基因的小鼠寿命可延长30%。p66Shc基因是活性氧族水平及与年龄相关的器官功能失调的重要调节因子。目前氧化应激过程参与人类疾病(高血脂、糖尿病、心血管疾病等)的发生发展过程已得到广泛认可。因此对于p66Shc基因的深入研究,可研制出相关靶向治疗药物,阻止或治愈与年龄相关疾病的发生。

在A549细胞中靶向p66^(Shc)shRNA的沉默效应

目的:在人非小细胞肺癌细胞A549细胞中探讨shRNA靶向慢病毒对信号衔接蛋白p66Shc的沉默效应,以更好地研究p66Shc的功能。方法:半定量RT-PCR和Western blot检测p66Shc下调后的变化情况,BrdU标记实验检测细胞的增殖变化情况。结果:在A549细胞中,运用p66Shc-shRNA干扰可以实现p66Shc在mRNA和蛋白水平的下调作用,同时发现A549细胞的增殖显著降低。结论:经过慢病毒载体介导的p66Shc-shRNA在人非小细胞肺癌A549中可获得高效转染效果,并能产生特异性的基因沉默效应,而且对细胞的增殖有显著的抑制作用,为进一步研究p66Shc功能提供了实验手段。

p66^(Shc)对亚砷酸钠诱导心肌细胞氧化应激的影响

目的探讨p66^(Shc)在亚砷酸钠介导的心肌细胞氧化应激中的作用。方法利用亚砷酸钠诱导的H9C2心肌细胞氧化应激模型,分别用CCK-8比色法检测细胞活力;双氯荧光素探针检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测p66^(Shc)、磷酸化p66^(Shc)的表达变化;免疫荧光共聚焦检测p66^(Shc)的亚细胞定位。结果与对照组相比,5μM亚砷酸钠处理组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高(P<0.001);砷引起了p66^(Shc)表达量增加,而且磷酸化p66^(Shc)与p66^(Shc)蛋白总量的比值也显著升高(P<0.05),p66^(Shc)在砷刺激下从细胞浆向线粒体转位。过表达野生型p66^(Shc)质粒增加砷介导的心肌细胞内ROS水平,而过表达突变型p66^(Shc)质粒和敲低p66^(Shc)的表达都降低砷处理组细胞内ROS水平。结论研究显示亚砷酸钠可能通过上调p66^(Shc)的表达和磷酸化水平诱导心肌细胞ROS水平的升高。

基于报告基因能筛选下调p66^(shc)基因转录的药物普筛系统的建立

将p66shc基因的启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,然后将重组质粒pGL3B-neo-p66shc转染入人的肺癌细胞A549中,通过单集落分离法得到含有重组质粒的稳定细胞系A549/p66shc。利用这个以报告基因为基础的药物普筛系统,筛选了数百种中药提取物及单体化合物,发现抑制率达到50%以上的2种中药提取物和8种单体化合物。

Shc相关磷酸化酪氨酸适配蛋白在大鼠血管衰老中的调控作用

目的探讨Shc相关磷酸化酪氨酸适配蛋白p66^shc 在血管衰老表达的变化，对阐明血管衰老对动脉粥样硬化的诊治具有重要意义。方法将Wistar大鼠分为4、10、16、24月龄组，测定各组血浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，同时采用恒速注入流体方法测定大鼠颈动脉血管的顺应性，并利用蛋白免疫印迹法分析各组p66^shc、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3水平。结果随增龄，大鼠主动脉管壁增厚，纤维化程度增高，MDA浓度明显升高（与4月龄和10月龄相比，均P〈0．01），SOD浓度明显降低（与4月龄相比，均P〈0．01；与10月龄相比，均P〈0．05），颈动脉血管的顺应性增高、弹性速率和弹性面积的差异有统计学意义（与4月龄相比，均P〈0．01；与10月龄相比，均P〈0．05），p66^shc、Caspase．3蛋白表达呈时间依赖性上调。结论血管衰老性重塑的分子机制之一可能与上调p66^shc、Caspase-3蛋白的表达有关，进一步阐明其调控机制可为延缓血管衰老、防治动脉硬化提供理论依据。