不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达

通过引物定点突变PCR法,扩增了猪肺炎支原体(Mhp)168株黏附因子P97基因抗原决定簇R1区基因片段,并将该基因片段插入表达载体pET-32 a(+)中构建重组质粒,再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。DNA序列分析结果表明所构建的重组质粒含有正确的目的基因。经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h,重组质粒表达的目的蛋白量可达到总蛋白的23%。W estern b lotting和ELISA试验结果证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性。

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterTMNi-NTA His.Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性。

屠宰猪猪肺炎支原体P36、P46、P97 R1、P146氨基酸序列的差异分析

为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

猪肺炎支原体P97R1抗原免疫刺激复合物的制备及对活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强肌肉注射免疫条件下猪肺炎支原体(Mhp)活疫苗的免疫刺激能力,并补充其缺乏的针对重要黏附因子P97R1的应答,本实验采用透析法制备含有P97R1的免疫刺激复合物(ISCOM-P97R1),并将ISCOMP97R1作为活疫苗的佐剂,通过小鼠模型进行免疫学评价。结果表明,电镜下观察所制备的ISCOM-P97R1具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30 nm^40 nm,P97R1蛋白的包封率可达85.6%。免疫后7 d即可在小鼠血清中检测到高水平的特异性P97R1抗体,并且其针对Mhp全菌蛋白的抗体也显著高于无佐剂的活疫苗对照组。结果表明,ISCOM-P97R1对Mhp活疫苗免疫刺激能力具有显著的增强作用,同时可以有效诱导产生针对P97R1的免疫应答,进一步增强了疫苗的保护能力。

猪肺炎支原体P97基因原核表达产物单抗的制备

目的 纤毛黏附因子P97是猪肺炎支原体特异性的外膜蛋白 ,该蛋白C端的R1区是其主要的抗原决定簇。本研究以大肠杆菌表达的P97黏附因子R1融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c鼠制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)平行筛选 ,获得两株单克隆抗体杂交瘤细胞株A9-H7、H11-E7。两株杂交瘤细胞经体外连续传代 1个月并冻存复苏后均能分泌高效价的抗融合蛋白抗体 ,并能在小鼠体内形成肿瘤 ,有效诱导产生高效价的腹水抗体。两株单抗腹水的ELISA效价分别为 1× 10 6和 1× 10 5。且均与天然Mhp16

猪肺炎支原体地方毒株P97-R1基因序列分析及原核表达

为克隆和表达猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae)地方毒株Z株P97-R1基因,探索不同菌株P97-R1基因的差异及其蛋白作为诊断抗原的可能性。本研究根据GenBank登陆的猪肺炎支原体(Mhp)232株P97基因,使用Primer Permier 5.0和DNAman设计引物,以猪肺炎支原体地方毒株Z株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出了P97-R1基因片段,并将该基因片段连接到T-easy和pET-32a载体上分别进行测序和原核表达。测序结果表明:与参考株232株序列对比分析发现Z株P97-R1区发生了多处碱基突变;经DNAstar软件分析表明Z株包含11个5aa重复序列,232株P97-R1区包含15个5aa重复序列,推测Rl重复序列的差异与菌株毒力强弱有关。Z株P97-R1基因原核表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量约为30KD的蛋白,经Western-blot鉴定表明该表达蛋白具有免疫原性。这为Mhp的诊断、预防及进一步深入研究奠定了基础。

重组蛋白CTB-P97R1对猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫效果的评价

为提高滴鼻免疫条件下猪支原体肺炎活疫苗的免疫效果,本研究设计引物扩增猪肺炎支原体P97R1基因,融合至霍乱毒素B亚单位(CTB)基因下游,构建了重组质粒p ET-CTB-P97R1。重组菌经IPTG诱导表达、分离纯化得到r CTB-P97R1重组蛋白。利用体外神经节苷脂(GM1)结合试验检测r CTB-P97R1的佐剂活性。随后将r CTB-P97R1与活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠,免疫后采血和收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),分别检测其中的特异性Ig G抗体和s Ig A抗体的水平评价免疫效果。结果显示,r CTB-P97R1可以特异性结合GM1,具有生物学活性。小鼠免疫后的血清Ig G抗体显著高于活疫苗对照组(p<0.01),同时产生了高水平的P97R1特异性Ig G抗体(p<0.01);小鼠BALF中的s Ig A抗体也显著高于活疫苗对照组(p<0.05)。结果表明,r CTB-P97R1能够显著增强经滴鼻免疫的猪支原体肺炎活疫苗的免疫效力,同时可提升P97R1的免疫应答,有望作为经黏膜免疫的猪支原体肺炎活疫苗的新型佐剂。

猪肺炎支原体黏附因子P97R1区单抗制备

猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）与呼吸道黏膜纤毛的特异性吸附是引起猪支原体肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswilqe，MPS）的先决条件.Minmn等研究表明，97蛋白R1区直接参与支原体与呼吸道纤毛的黏附，同时P97的主要抗原决定簇也位于该区域。P97R1区在猪8市炎支原体的检测诊断与致病机理研究方面具有重要意义。本研究以纯化的猪肺炎支原体全菌蛋白作为免疫原，以大肠杆菌表达的P97R1融合蛋白作为筛选抗原制备锗肺炎支原体P97R1区的特异性单抗，为Mhp的诊断检测及致病机制研究提供基础。

猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用(英文)

[目的]研究猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用。[方法]根据Genbank中猪肺炎支原体P97R1基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白P97R1基因,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P97R1;PICZα-A-P97R1经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115;将PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P97R1蛋白于发酵上清液中,并通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting对其进行鉴定。[结果]P97R1蛋白基因获得了分泌性表达,表达量达499μg/ml,而且具有良好的反应原性;同时用表达蛋白经过各项优化建立了猪肺炎支原体间接ELISA检测方法,经检测该方法具有良好的特异性和重复性。[结论]该研究为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

猪肺炎支原体黏附因子P97蛋白研究进展

猪肺炎支原体(Mhp)是引起养猪企业损失的重大猪呼吸道疾病,而黏附因子P97蛋白是Mhp发病的主要致病因素。为了解P97蛋白对猪支原体肺炎致病机理,本综述分析了国内外关于猪肺炎支原体P97蛋白的研究论文,从黏附因子P97的分子结构、免疫原性,以及P97蛋白基因工程疫苗研发等多方面进行归纳,阐述了P97的研究现状。P97蛋白能够刺激机体产生特异性抗体,具有非常好的免疫原型,是构建重组蛋白疫苗的重要候选蛋白,能够为建立猪肺炎支原体实验室诊断和生物工程疫苗研制提供参考。

家蚕二分浓核病毒DNA聚合酶基因启动子P97的研究

家蚕浓核病毒2型(BmDNV-2)已被正式命名为家蚕二分浓核病毒(BmBDV),该病毒致使家蚕罹患浓核病。BmBDV是目前已知唯一能够编码DNA聚合酶的ssDNA病毒,DNA聚合酶的表达对该病毒复制至关重要。使用双荧光素酶报告系统检测BmBDV DNA聚合酶基因启动子P97的活性以及病毒潜在的调控蛋白或宿主的互作蛋白对P97的调控作用。BmBDVDNA聚合酶翻译起始位点上游286 nt序列具有启动子活性,但其活性比病毒非结构蛋白NS1基因启动子P5的活性弱。共转染瞬时表达病毒的NS1蛋白使P97启动子活性降低,而病毒的结构蛋白VP则可提高P97启动子活性;宿主家蚕的转录因子Twist蛋白的表达能够提高P97启动子的活性,但其调控作用较小。

纪念“实用药动学计算程序3P87/3P97”诞生30年

1前言 随着科学技术的进步,回过头来看看某一事件的发生和发展过程,会觉得处于现在是轻而易举的事情,因为计算机已经普及,好多数据只要输入原始数据就能在几分钟内看到结果,认为重要的是结果,如何得到的结果并不想知道,也不重要。我曾不只一次说过,如果没有计算机,没有计算工具和软件,能够用笔将药代参数正确算出,算你有本事,算你数学功底好!

猪肺炎支原体黏附因子P97基因抗原区的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体J株模式株(ATCC25934或NCTC10110),设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出猪肺炎支原体168株特异性蛋白P97基因序列的R1R2区序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pET-32a(+)的EcoRI和XhoI位点之间,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS_PAGE电泳进行鉴定,结果表明,p97蛋白基因获得了表达,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断以及新型疫苗的研制提供了重要条件。

猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达

本研究从猪肺炎支原体的主要抗原蛋白及其免疫特点出发,将猪肺炎支原体纤毛粘附决定区R1区基因和具有黏膜免疫佐剂作用的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(the B subunit of heat-labile enterotoxin LTB)基因重组表达,并且单独表达了R1区基因。将扩增的目的片段插入到表达载体pET-28a(+)中,分别构建了两个原核表达质粒pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1,诱导表达了两个融合蛋白rLTBR1和rR1。对表达的目的蛋白进行了SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为进一步的研究rLTBR1融合蛋白在黏膜免疫方面的作用打下了基础。

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎（MPS）有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以2011年—2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株（GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15）和3株广西其他品种猪Mhp毒株（GX227、GX595、GX674）的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97R1区五氨基酸（AAKPV/E）重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。

非小细胞肺癌中p97蛋白的表达及其临床意义

目的 研究腺苷三磷酸酶（p97）在非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）组织中的表达及与侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组织化学和Western-Blot方法对60例NSCLC、癌旁组织以及10例正常肺组织进行D97蛋白定位表达及表达水平研究。结果 在免疫组化试验中，p97在NSCLC组织中的阳性表达率为65．0％（39/60），瘤旁组织为28．3％（17/60），两者比较差异有统计学意义，X^2=6．1，P=0．047；在Western印迹实验中，p97在NSCLC组织中的阳性表达率为81．7％（49/60），瘤旁组织为35．0％（21/60）。非肿瘤肺组织为10％（1/10），差异有统计学意义。X^2=7．5，P=0．023。Western印迹与免疫组化检查结果明显正相关性。r=0．293。P〈0．05。在NSCLC组织中，p97蛋白阳性表达率与肿瘤转移（P=0．0020）和肿瘤分期（P=0．0150）之间的差异有统计学意义；而与瘤体大小、病理分级、组织类型的差异无统计学意义。结论 NSCLC在蛋白水平上表达p97增加，与肺癌侵袭和转移有关。

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。

利用酵母随机展示技术对猪肺炎支原体P97上B细胞表位的筛选和鉴定

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。