番茄果实特异表达载体pBI121-2A11-HB-1的构建及其对农杆菌的转化

为了解乙烯生物合成调控机理,本研究利用聚合酶链式反应技术,从番茄Micro-Tom中克隆2A11果实特异型启动子和LeHB-1基因,构建LeHB-1正义和反义果实特异表达载体,并导入根癌农杆菌GV3101中,为下一步通过转基因操作来研究转录因子LeHB-1在果实发育过程中的生物学功能奠定了实验基础。

翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定。

白颖苔草热激转录因子(HSF1)真核表达载体的构建

根据表达载体PBI 121特性及酶切位点设计合适的引物,由表达引物通过PCR技术从含有白颖苔草(Carex rigescens)CrHsf全长cDNA的克隆载体的大肠杆菌上扩增出带有特定酶切位点的CrHsf完整开放阅读框。再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后将正确的目的基因片段亚克隆至PBI 121植物表达载体。通过PCR及酶切鉴定,结果证明,目的基因片段已被正确克隆到表达载体上,载体构建成功。

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810bp的产物。VP1基因和pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础。

狂犬病病毒N基因植物表达载体的构建

以提取的狂犬病病毒总RNA为模板,以N1和N2为引物,反转录为cDNA,然后再以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-N,采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法及PCR确认正确后,利用pMD18-T-N重组质粒为模板,以N3和N4为引物,成功构建了重组植物表达载体pBI121-N。

新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达

为了克隆新城疫病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城疫病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,并其通过电转化导入根癌农杆菌中,以根癌农杆菌为介导将HN基因导入苜蓿细胞。最终成功构建了重组表达质粒pBI121-HN,并通过根癌农杆菌转染苜蓿细胞将其在苜蓿中成功表达。本试验为家禽的植物性苜蓿疫苗的研究奠定了基础。