磁场对质粒pBR322DNA的影响

讨论了经５００ｍＴ、９００ｍＴ、１２００ｍＴ、１５００ｍＴ恒磁场作用后的质粒ｐＢＲ３２２ＤＮＡ与Ⅱ型限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ、ＰｕｖⅡ、ＴａｑⅠ、ＢｇｌⅠ、ＲｓａⅠ、ＨｉｎｆⅠ、ＡＰａⅠ、ＫｐｎⅠ等的单酶解、双酶解及多酶解反应。从琼脂糖电泳分离酶解片段的结果，发现经磁场作用过的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ在３３６１—６３１ｂｐ的区段内产生了一个被ＨｉｎｆⅠ识别的新序列ＧＡＮＴＣ，证明了磁场作用能引起ＤＮＡ点突变。

pBR322质粒DNA的原子力显微镜成象及剪切研究

研究DNA分子间和分子内相互作用力,可以帮助人们了解DNA分子的结构及其功能.由于对这些相互作用力进行直接测量时,不仅需要控制体系的稳定性,同时外加作用力又不能对体系产生影响.因此,目前只是利用X射线,光散射和核磁共振等手段对作用力进行直接的物理或热力学测量.虽然渗透压技术已经应用到DNA双螺旋非特定分子间力的测量,但对于具有特定取向的复杂分子相互作用,就需要在单个分子间进行直接测量.原子力显微镜(AFM)可以检测到10^(-14)N数量级的针尖-样品相互作用力,横向分辨率可达0.01nm,而接触面积只有10nm^2,并且可以在近生理溶液条件下操作,因此它是非常适合研究DNA分子间相互作用力的.事实上,利用AFM研究Biotin-streptavidin体系中的单个分子间相互作用以及DNA双链间的相互作用力已有报道.

质粒PBR_ （322）－脂质体的制备及其内含DNA的转移

采用改进的逆相蒸发法（ＲＥＶ）制备卵磷脂／胆固醇（７：３，ｍｏｌ／ｍｏｌ）脂质体，并用于包裹荧光特异标记的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ，构建了基因转移载体，然后将纯化的质粒ＰＢＲ３２２ＤＮＡ－脂质体与悬浮的白菜原生质体一起温育．经对ＤＮＡ－ＤＡＰＩ荧光复合物的镜检，证明ＤＮＡ被包裹到卵磷脂／胆固醇脂质体内．被包装的ＤＮＡ能有效地避免外源ＤＮＡａｓｃ的降解作用．且质粒ＤＮＡ通过脂质体与原生质体膜的融合可随脂质体导入原生质体内．

质粒pBR322的γ辐射损伤效应

采用琼脂糖凝胶电泳及激光密度扫描仪和积分分析,观察了质粒pBR 322 DNA的γ辐射效应。发现随照射剂量的增加,超螺旋质粒所占比例逐渐下降,而开环质粒所占比例相应升高;运用OH自由基清除剂甲酸钠进一步观察到清除OH自由基后,质粒pBR 322的辐射效应大为减轻。结果提示其损伤主要是通过水的辐解产物OH自由基的间接作用而引起的。

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101-pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对质粒的稳定性和β(内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在33(39oC、pH为6.4-7.2、DO为 40%-80%、 补料速率在5.4-10.8 g/h范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.

三核铜配合物[Cu_3L_2](ClO_4)_2(H_2L=1,3-双(2-羟基-1-苯基-亚甲基)-丙烷)的合成与对pBR322 DNA的切断作用

利用席夫碱配体 [H2 L =1,3 双 (2 羟基 1 苯基 -亚甲基 ) -丙烷 ]与铜盐作用 ,得到了配合物 [Cu3 L2 ] (ClO4) 2 ,并用X射线单晶衍射测定了其晶体结构 .研究了该三核铜配合物与质粒pBR3 2 2DNA之间的相互作用 ,琼脂糖凝胶电泳实验结果表明该配合物能够将pBR3 2 2DNA从超螺旋构型切割成开环型和线型 .同时 ,紫外光谱实验可以推测 ,配合物在对pBR3 2 2DNA进行切断时 。

BglⅠ限制性核酸内切酶与环状pBR322-DNA专一性和非专一性相互作用的动力学及热力学

本文选择限制性核酸内切酶BglⅠ和pBR322-DNA为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法来研究内切酶对环状DNA分子的专一性和非专一性结合及切割过程,求得了各限制位点的切割速度k及活化能E,各限制位点催化速度常数k_c,酶同限制位点专一性结合的平衡常数k_S非专一性结合的平衡常数k_N及其热力学参数△H,△S。研究表明:不论底物的构型如何(线状还是环状),内切酶都以相似的动力学和热力过程对其进行结合与切割。

利用PBR322质粒监控MSAP甲基化检测过程

[目的]监控MSAP甲基化检测过程,以控制MSAP每一反应步骤。[方法]利用PBR322质粒作为阳性对照,全程监控MSAP分析中酶切、连接、预扩与选扩体系。[结果]PBR322质粒作为阳性对照电泳时条带有限,可以根据条带有无和位置对MSAP甲基化检测过程进行全程监控,有助于发现问题的具有所在。[结论]该研究可以为MSAP技术提供可靠保障。

化学核酸酶的合成、表征及与pBR322DNA的作用

合成了三角架配体 L ,用红外光谱、核磁共振氢谱、X单晶衍射等手段对配体进行了鉴定。在此基础上 ,用高氯酸镁与其合成镁的金属络合物 ,通过核磁共振氢谱、红外光谱等手段对配合物的结构进行了表征。最后 ,通过电泳技术研究了此配合物与 p BR32 2 DNA的作用 ,并对机理进行了初步探讨。电泳结果表明 :配合物在生理条件下 (p H=7.0 ,37℃ )与 p BR32 2 DNA反应 2 h,能够断裂DNA ,有的甚至断裂成线性。本工作的意义在于 :配合物在生理条件下 ,能迅速水解 DNA,甚至出现了线性断裂产物。

基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中,DNA损伤不能修复导致细胞凋亡或者细胞无限增殖而形成的。DNA在细胞中转录和翻译都会涉及蛋白与DNA的结合,肿瘤抑制蛋白也是参与这一过程的关键蛋白之一。然而,众多研究发现,肿瘤抑制蛋白p53具有识别和修复损伤DNA的效果,对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义。有研究表明,金属镁离子和锌离子可以增强p53蛋白的结构稳定性和p53-DNA的亲和力。因此,我们基于原子力显微镜(AFM),直观地呈现出p53蛋白与PBR322环状DNA相互作用的图像,同时发现p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。但是,对于长度相当的5 000bp的线状DNA几乎没有这样的效果,而对于20 000bp DNA不会出现这样的现象。然而,在高浓度镁离子环境下,环状DNA会扭转成为麻花状,即形成超螺旋结构。这一现象,可为p53蛋白功能和作用机理研究提供指导,也为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启发。

稳态和时间分辨荧光光谱法检测pBR322质粒中十字形结构

在目的DNA不被酶切成不同片段的情况下,应用光谱方法探测pBR322质粒中十字形结构DNA的形成。吡咯脱氧胞苷(Pyrrolo deoxycytidine,PdC)取代dC掺入到pBR322质粒的特定位点(3195,3222或3281位点)。应用稳态和时间分辨荧光法研究十字形结构DNA的形成。结果显示:(1)稳态荧光特性表明,当PdC掺入到pBR322质粒的3222位点,PdC-pBR322超螺旋荧光强度大约是松弛型PdC-pBR322的4倍;与此同时,其时间分辨荧光寿命大约比松弛型PdC-pBR322长约0.3ns。当PdC掺入到3195或3281位点时,稳态荧光光谱和荧光寿命(两位点处约1.42ns)并没有显著变化。(2)随着盐浓度的增大,荧光寿命略微有变化,但不是很明显。通过检测和分析pBR322质粒的荧光光谱和荧光寿命,表明能够形成在非配对环状部分3222位点含有dC的十字形结构。在一定的盐浓度(0-100mmol/L)条件下,十字形结构能够保持其稳定性。

双链DNA直接测序法在环境诱变剂研究中的应用——Ⅱ.GMA诱导的pBR322突变Ap^RTc^S中四环素抗性突变基因片段的序列测定

GMA(Glycidyl Methacrylate)是我们实验室首先报道的一种新的环境诱变剂。为了探讨它的致突变分子机制,采用DNA重组、基因转移及遗传工程技术研究了GMA对质粒pBR322突变的Tc基因一级结构的改变。

氯化钇对质粒pBR322转化的影响

用含 50 μmol/ L钇 ( )的氯化钙诱导大肠杆菌进入感受态 ,质粒 p BR32 2的转化率提高2倍 ;若在热休克后使感受态细胞在含 50 μmol/ L氯化钇的营养培养基 (SOC)中复壮 ,则转化率提高 5倍 .实验结果表明 :微量氯化钇存在的条件下 ,钇 ( )可能比钙 ( )更易形成抗 DNase的羟基 -钇 ( ) -磷酸复合物 ,更易于被细胞吸收而提高了质粒的转化率 .

质粒DNA提取的简便方法

以质粒pBR322为对象,在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进,将酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提省去。比较了简便方法和经典方法提取质粒的效果,结果显示:两种方法均能够提取出质粒DNA,RNA的量并没有比经典方法提出来的多;简便方法抽取的质粒,蛋白含量稍稍多于后者;简便方法节省了大约一半的提取时间及大量的药品,并且减少了有害的化学物质对人体的危害,是一种经济实用的方法,完全可以满足一般实验需要。

姜黄素诱导质粒DNA氧化损伤的体外实验

[目的]以姜黄素-Cu^2＋-质粒pBR322DNA离体反应体系，探讨姜黄素对DNA的损伤作用及其机制。[方法]在不同浓度Cu^2＋（0-200μmol／L）或抗氧化剂条件下，姜黄素与质粒pBR322DNA于37℃反应0—4h。经琼脂糖凝胶电泳后，扫描采集电泳图像，测定质粒DNA各种构型的光密度值，计算超螺旋型DNA所占的百分比（SC％）。[结果]①单独的姜黄素或Cu^2＋作用不引起DNA损伤；在[Cu^2＋]〉100μmol／L时，姜黄素诱发DNA剂量依赖性损伤；②姜黄素（200μmol／L）＋Cu^2＋（200μmol／L）对DNA的损伤呈现时间依赖性增强反应；③抗氧化剂——叠氮化钠（NaN3）、硫脲（TU）、过氧化氢酶（CAT）能明显抑制姜黄素和Cu^2＋造成的DNA损伤；Cu^＋的特异络合剂BCS（hathocupminedisulfnnic acid）也能抑制损伤作用。[结论]姜黄素在一定浓度Cu^2＋存在下。可引起DNA的氧化损伤，并具有剂量-反应关系和时间-效应关系。

钌(Ⅱ)配合物光谱性质及对DNA光切割作用

用紫外吸收光谱、荧光光谱和荧光淬灭技术,研究钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(bpy)2(MDBIP)]2+(bpy为2,2′-联吡啶;MDBIP为3,5-二溴基-咪唑并[4,5-f][1,10]邻菲咯啉)与小牛胸腺DNA的作用.用琼脂糖凝胶电泳法研究配合物对pBR322质粒DNA的光切割作用.结果表明,[Ru(bpy)2(MDBIP)]2+与小牛胸腺DNA可能是以一种弱的部分插入的方式相结合,对pBR322质粒DNA有较好的光切割作用.

槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA损伤

建立牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)-还原糖、牛血清白蛋白-甲基乙二醛/乙二醛(bovine serum albumin-methylglyoxal/glyoxal,BSA-MGO/GO)反应体系,研究槲皮素对反应体系中晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts,AGEs)的抑制作用。考察了槲皮素在不同阶段对BSA-核糖体系中AGEs形成的抑制作用。并对槲皮素抑制二羰基化合物对质粒pBR322DNA的损伤进行研究。结果表明:槲皮素具有抑制BSA-还原糖、BSA-GO、BSA-MGO体系中AGEs形成的作用,达到显著抑制效果的浓度分别为1、0.25、0.25 mmol/L。槲皮素对BSA-MGO体系中AGEs产生的抑制作用强于BSA-GO体系。在BSA-核糖体系中,反应初期随着反应时间的延长抑制作用不断增大,12 d后,抑制作用趋于平缓,维持在60%左右。槲皮素对二羰基化合物对DNA的损伤有抑制作用,且与浓度成一定相关性。

华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ的影响

背景与目的:华蟾素注射液是传统抗肿瘤中药制剂,目前药效机制尚不明确。本研究旨在探讨华蟾素注射液对DNA拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ,TOPOⅠ)的影响。方法:采用噻唑蓝还原法(MTT)观察华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响;采用流式细胞术(FCM)检测对HepG-2细胞周期的影响;采用RT-PCR法检测对HepG-2细胞TOPOⅠmRNA表达的影响;采用TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322 DNA解旋反应检测华蟾素对TOPOⅠ酶活性的影响;采用负超螺旋PBR322 DNA检测华蟾素对DNA的直接抑制作用。结果:华蟾素注射液对HepG-2细胞增殖具有抑制作用,其抑制效应具有时间和剂量依赖性;并将HepG-2细胞阻滞于S期;RT-PCR检测表明,华蟾素注射液可下调TOPOⅠmRNA表达,表现浓度依赖效应;对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322 DNA解旋反应有抑制作用;对负超螺旋PBR322 DNA没有直接抑制作用。结论:华蟾素注射液能够抑制HepG-2细胞增殖,影响DNA拓扑异构酶Ⅰ酶的mRNA表达及活性可能为机制之一。

Genefinder和EB在DNA电泳谱带定量分析中的比较

[目的]比较Genefinder和EB对DNA电泳谱带定量分析的影响。[方法]用加入Genefinder或EB的琼脂糖凝胶进行PBR322DNA电泳,并用凝胶成像分析系统进行标准曲线相关性等分析。[结果]用Genefinder作染料,标准曲线相关性、样品含量百分误差、灵敏度等都比EB好。[结论]用Genefinder作染料不仅提高了定量分析的质量,而且安全、无污染,有利于保护环境。

全反式维甲酸合钇(Ⅲ)配合物对DNA的切割和键合作用(英文)

以紫外光谱、荧光光谱、粘度法和凝胶电泳方法研究了全反式维甲酸合钇!配合物与DNA的作用。结果表明,该配合物能在生理条件下比配体和金属离子更有效地切割质粒DNA,体系离子强度和pH值的变化对配合物的切割活性有较大影响,自由基捕捉剂的加入不影响配合物的切割活性。该配合物对DNA的切割可能通过水解机理进行。该配合物可使DNA的粘度增加,使EB-DNA体系的荧光强度和DNA溶液的紫外吸收强度降低。据此推断,该配合物主要以嵌入方式与DNA作用。