天蚕素A-蜂毒素杂合肽用pBV220载体的表达、纯化和活性测定

为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首先将其拼接成融合肽的完整基因,然后通过前后接头将融合肽基因连接成两侧具有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。将5份拷贝的基因克隆至pBV220表达载体,转化E.coliDH5α,温度诱导得到表达量为35%的融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体溶解,经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析获得纯化的融合蛋白。融合蛋白再经CNBr切割和阳离子交换层析,得到纯化的抗菌肽,经蛋白质N端测序确认序列正确。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。

pBV220载体中外源基因表达水平定量分析

运用基于螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构预测与密码子偏性计算等序列分析技术，分析了ｐＢＶ２２０载体中携带的人白细胞介素２、人白细胞介素４等２２个外源基因的表达水平。结果表明：５′端－３０～３９区域和３′端３０～－３９区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义；其次是３′端９ｂｐ的局部密码子偏性，ＳＤ序列与起始密码子ＡＴＧ之间碱基数在８±３范围内与表达水平无显著关系。另外，运用判别分析方法构建了判别函数，判别符合率高达９５．５％。

质粒pBV220-PTD-tCNTF转化BL21菌株感受态细胞的高效制备方法

目的比较几种常用大肠杆菌感受态制备方法,探讨影响pBV220-PTD-tCNTF转化大肠杆菌感受态细胞的因素并得出最优水平组合。方法采用4种制备感受态细胞的方法即CaCl2法,CaCl2-甘油法,TSSG法和INOUE法,比较4种方法制备的感受态细胞即时和-80℃保存30 d对质粒PBV220-PTD-tCNTF的转化效率;L8(27)正交设计研究Mg2+、INOUE重悬液、PEG、甘油和DMSO对pBV220-PTD-tCNTF转化大肠杆菌感受态的影响;对得出的最佳水平组合进行验证并对转化好的细胞进行测序验证。结果 CaCl2法,CaCl2-甘油法,TSSG法,INOUE法4种方法的转化率分别为:(5.43±0.72)×106、(7.45±0.65)×106、(9.71±1.81)×106、(8.52±1.22)×107;-80℃保存30 d的转化效率为:(6.20±0.31)×104、(6.57±0.97)×106、(9.76±1.31)×106、(1.63±0.019)×106;正交结果 Mg2+(A)、IN-OUE重悬液(B)、PEG(C)、甘油(D)和DMSO(E)各因素的P值分别为0.0357、0.0154、0.0677、0.2503和0.1749;最佳水平组合实施的转化率为(29.63±4.95)×107并经测序确定转入质粒的正确性。结论分析出各因素对pBV220-PTD-tCNTF转化感受态细胞转化率的影响程度,得出了其最佳水平组合A1B1C1D2E1,并得到了(29.63±4.95)×107的转化效率。

pBV220载体中外源基因高效表达的自动化设计

pBV220载体是国内科学家构建的原核系统表达载体,目前仍在广泛应用.但是,实现外源基因的高效表达需要综合考虑诸如RNA二级结构等多种因素,极其耗时费力.为此,基于我们提出的pBV220载体中外源基因高效表达数学模型,编写了外源基因高效表达的自动化设计软件,并可定性用于原核系统其它载体中外源基因表达水平分析,最终为加快实验进程提供帮助.

IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化

采用三角瓶小量法振荡培养，对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。在37。C时诱导，对起始OD600值（0．40±0．025～0．65±0．025）进行筛选；在42℃时诱导，对起始OD600值（O．40±0．025～0．65±0．025）进行筛选；在37℃和42℃时诱导，分别对诱导时间（5、6、7、8h）及待选培养基（R1、R2、R3）进行筛选。以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价。结果表明，37℃时诱导，最适宜起始OD600为0．45±0．025，最佳诱导时间为7h，最佳培养基是R1；42℃时诱导，最适宜起始OD600为0．40±0．025，最佳诱导时间为5h，最佳培养基是R2。42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时。因此，以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDVVP2基因，在37℃时诱导表达要比42℃时好。

pBV220载体中外源基因二级结构与表达水平关系

运用极小化自由能RNA二级结构预测方法分析了pBV220载体中以表达水平20％作为分类标准的人白细胞介素2、人白细胞介素4等32个外源基因表达水平,结果表明5′端32～41区域和3′端25～46区域的二级结构自由能与表达水平具有显著的统计学意义,并运用Bays判别分析方法构建了判别函数,判别符合率为87.5％。

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。

基于PBV条件下正弦与余弦积分的收敛性

基于文献[2]中的思想,将系数数列的PBV条件推广到函数的PBV条件,分别给出了PBV条件下正弦积分与余弦积分一致收敛性的充分必要条件(见定理1和定理2),并利用Cauchy收敛准则、分部积分等一些数学技巧去证明,最后给出了PBV条件中一个性质不可缺少的例子。

PBV330——1100真空斩拌机的应用

午餐肉罐头是罐头食品中最普遍的、年产量在几万吨以上的一种大宗产品、畅销港澳、东欧等国家,在国内市场上也逐渐被消费者所喜爱。作为生产厂家,午餐肉产值高、创汇多,且可以调节季节,是一种比较受欢迎的产品。但是目前原料猪肉价格高,每吨肉进价在5800元左右,加上时有质量问题,生产午餐肉往往要亏本。为此。

PE患者应用双源双能量CT诊断的临床价值分析

目的:探讨肺栓塞(PE)患者应用双源双能量CT(Dual-source and dual-energy CT)诊断的临床价值分析。方法:选取2020年1月至2022年3月我院收治的疑似PE患者966例,均接受双源双能量CT诊断。分析CT肺动脉造影(CTPA)和肺血管(Lung Vessels)图像在诊断肺栓塞中的一致性、CTPA和肺灌注(Lung PBV)图像在诊断肺栓塞中的一致性以及分析CTPA+Lung Vessels、CTPA+Lung PBV、CTPA三种诊断方法检出肺栓塞情况。结果:CTPA和Lung Vessels在诊断肺栓塞中的一致性Kappa值为81.57;CTPA和Lung PBV在诊断肺栓塞中的一致性Kappa值为82.34;CTPA+Lung Vessels检出肺栓塞总数为85例,CTPA+Lung PBV检出肺栓塞总数为82例,CTPA检出肺栓塞总数为76例。结论:PE患者临床诊断过程中,双源双能量CT诊断效果理想,临床上应当进一步推广应用。

大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达

目的将大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)克隆到表达载体pBV220,使LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中稳定表达。方法将LTB基因克隆到表达载体pBV220中,再分别转化大肠埃希菌DH5α和婴儿双歧杆菌,使之表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定。并通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。结果LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中均可稳定表达,毒性实验证明LTB保留轻微的毒性。结论稳定表达LTB的双歧杆菌为今后的口服疫苗佐剂奠定了基础。

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体 p BV2 2 0 ,通过 PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征( PRRS)病毒 BJ-4株核衣壳蛋白 ( N)基因起始密码子上游进行了改造和修饰 ,成功地构建了含有 PRRS病毒 N基因的原核重组表达载体 p BV-N。 p BV-N转化大肠杆菌 DH5α,温度诱导后菌体裂解物经 SDS-PAGE分析发现 ,在约 1 5 0 0 0处出现 1条诱导前后的 p BV2 2 0载体对照和诱导前的 p BV-N中均缺少的特异性的蛋白条带 ,分子量大小与 PRRS病毒 N蛋白相符 ,并随着诱导时间的延长而变化 ,在诱导后 4 h达到高峰。薄层扫描结果显示 ,重组 N蛋白表达量最多可占菌体总蛋白的 2 7.4 %。 Western-blotting检测 ,此 1 5 0 0 0的蛋白带可为 PRRS病毒 N蛋白的单克隆抗体所识别 ,表明该重组

影响人干细胞因子基因高效表达的因素探讨

目的 分析SD序列长度、基因起始码ATG和终止码TAA上下游处RNA的二级结构及密码子偏性等影响表达效率的主要因素,以期实现重组人干细胞因子在原核细菌中高效表达。方法 分析并修改编码人SCF氨基酸的密码子,分段合成改造后的基因,PCR一次性完成拼接,将基因克隆到pBV-220载体上,诱导表达。结果 天然人SCF基因在pBV-220载体的表达占菌体总蛋白的9.5％,基因改造后SCF占菌体总蛋白的27％,表达的蛋白能够为SCF的单克隆抗体所识别,初步纯化的SCF蛋白纯度大于80％,能够促进Mo7e细胞的增殖活性。结论 密码子偏性是影响SCF在原核细菌中高效表达的主要因素,通过改变密码子偏性能过实现高效表达。

嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究

【目的】探讨鱼源嗜水气单胞菌菌蜕系统的可行性和应用性。【方法】以PhiX174基因组DNA为模板,对LysisE基因进行PCR扩增,并将纯化的PCR产物与原核表达载体pBV220双酶切后连接,构建溶菌质粒pBV220-LysisE。将pBV220-LysisE转入嗜水气单胞菌LN0925株中,构建LN0925(pBV220-LysisE)菌蜕疫苗(AHGs),进而通过溶菌动力学过程检测、电镜下细菌形态观察和动物免疫保护试验等评价所制备的菌蜕疫苗。【结果】PCR扩增成功获得长度为276bp的噬菌体LysisE基因;成功构建pBV220-LysisE重组质粒及AHGs。在42℃诱导60min后,LN0925(pBV220-LysisE)菌株开始出现溶菌现象,至3h后溶菌基本结束;溶菌至210min时,其裂解效率达到99.99%。菌液浓度对菌蜕裂解效率的影响试验表明,不同浓度质粒pBV220-LysisE均可以高效诱导嗜水气单胞菌LN0925株裂解。电镜观察发现,AHGs形成明显的溶菌孔道,整体细胞形态完好,且内容物流失。动物免疫保护试验结果表明,AHGs疫苗能明显提高鲤鱼的血清抗体水平,在免疫后5-6周血清抗体凝集效价达到1∶256,从第7周开始呈下降趋势;AHGs和甲醛灭活疫苗(FKC)的相对保护率分别为77.78%和55.56%。【结论】AHGs能够有效激活鱼体的免疫系统并产生免疫保护,且较FKC具有更好的免疫保护效果。

产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ基因克隆与表达

目的:在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenio escherichia coli,ETEC)定居因子CFA/Ⅰ,检测重组表达的ETEC CFA/Ⅰ。方法:以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物用SDS-PAGE鉴定,免疫原性实验验证。结果:成功构建了pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性。结论:CFA/Ⅰ基因的成功克隆为今后的ETEC CFA/Ⅰ候选疫苗研制奠定了基础。

人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定

根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切鉴定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础.

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上，重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰，修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性，建立了一条简便、稳定，适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体，８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体，稀释复性蛋白，之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白，每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底。