甲状旁腺功能低下症基因治疗中重组表达体系pCKM-mPTH质粒的构建与表达

目的 研究构建重组表达体系pCKM mPTH质粒 ,寻找甲状旁腺功能低下症的基因治疗途径。方法 采用重叠聚合酶链反应 (PCR)法、巢式PCR法及粘端连接法构建pCKM mPTH质粒 ,以脂质体转染骨骼肌细胞 ,用 β actin半定量和放免法分别测定其在细胞内外的表达。结果 嵌合基因pCKM mPTH质粒测序完全符合已知核苷酸序列 ,并完成定点突变 ,转染骨骼肌细胞后 ,β actin半定量法测得mPTH在细胞内成功高效表达 ,放免法测得 2 4h克隆细胞培养液中甲状旁腺激素蛋白的含量为 2 6 3 7ng/L。结论 成功构建了SD (SpragueDaw ley)大鼠重组基因表达体系 pCKM mPTH质粒 。

用重组表达体系pCKM-mPTH质粒治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的研究重组pCKMmPTH质粒在SD大鼠甲状旁腺功能低下症模型中的治疗作用。方法将30只SD大鼠随机分为3组,A组为正常组,肌肉注射生理盐水,B组、C组制作甲状旁腺功能低下症模型后,分别肌肉注射pcDNA31(+)空质粒和pCKMmPTH质粒。用放免法测定不同时间的血清甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果动物模型在注射pCKMmPTH质粒后,其血清PTH浓度在近1个月内显著高于注射前及空质粒对照组,未观察到有甲状旁腺功能低下症的表现。结论应用pCKMmPTH质粒治疗SD大鼠的甲状旁腺功能低下症是有效的,对未来的临床应用研究有一定的指导意义。

NDUFS6蛋白生物信息学分析及过表达质粒的构建与鉴定

目的 应用生物信息学方法分析线粒体呼吸链复合体Ⅰ结构亚基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(泛素)铁硫蛋白6(NDUFS6)的理化性质,构建pCV702-NDUFS6过表达质粒并进行鉴定,为进一步研究NDUFS6蛋白功能奠定基础。方法 利用Expasy、UniProtKB、NCBI、SOPMA等生物信息学工具分析NDUFS6蛋白的理化性质、二级结构等;根据NDUFS6 cDNA序列构建携带NDUFS6基因的过表达质粒pCV702-NDUFS6,转染大鼠心肌细胞H9C2,并设置阴性对照(NC)组和相应空载体CON520作为阳性对照(PC)组,经嘌呤霉素筛选后,采用RT-qPCR和Western blot检测NDUFS6 mRNA和蛋白表达水平。结果 NDUFS6蛋白由116个氨基酸组成,理论等电点pI为9.37。蛋白二级结构以无规则卷曲(占50%)为主。酶切鉴定和基因测序结果显示,pCV702-NDUFS6表达质粒构建成功。RT-qPCR和Western blot结果显示,相较于NC组和PC组,过表达组NDUFS6表达水平均上调(P均<0.05)。结论 成功构建了能在心肌细胞H9C2中有效过表达NDUFS6基因的过表达质粒。

创伤弧菌溶血素基因vvhA质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用

针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状,本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作。首先构建了创伤弧菌毒力基因vvhA的重组质粒,经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉,然后对其进行PCR定性检测及紫外分光光度计法定量分析。均匀性检验结果表明,样品间无显著差异,均匀性良好,符合预期目标;短期稳定性检验结果表明,样品能在4℃、37℃条件下稳定保存14天;长期稳定性检验结果表明,样品能在-20℃条件下稳定保存至少12个月。研究结果表明,创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求,为创伤弧菌的快速、高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质。将标准样品应用于鱼类、贝类等10份海鲜类食品样品的检测中,经传统培养法验证,检测结果准确无误。本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力,为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础。

转基因大豆多靶标质粒DNA标准分子的研制及应用

【目的】为了确保转基因检测技术的标准化和准确性,开发一种适用于转基因大豆定性定量检测的多靶标质粒标准分子。【方法】针对13种转基因大豆转化体的分子特征信息,合成了含有多靶标序列的核酸片段,通过将外源片段插入pUC57质粒多克隆位点并经大肠杆菌转化,研制了含有27个转基因大豆靶标序列的质粒DNA标准分子pUC57-SOY。采用普通PCR、单重、双重实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法对DNA标准分子pUC57-SOY的靶标特异性进行测试,利用13种大豆转化体进行定量检测适用范围和定值参数性能进行评估。【结果】在普通PCR检测中,质粒DNA包含的24种检测靶标,均能稳定扩增,且无非特异性扩增产物,表明质粒DNA标准分子pUC57-SOY在实际检测中具有良好的特异性;实时荧光定量PCR(qPCR)方法测试表明,质粒标准分子的不同浓度与靶标扩增效率具有良好的线性相关性。以pUC57-SOY标准分子为阳性参照物,应用标准曲线内插法,实际样品检测结果与预期相一致。【结论】开发的多靶标质粒标准分子pUC57-SOY表现出符合转基因成分定性定量检测要求的优良性能。在定性检测中,24种检测靶标均能稳定检测出并具有良好的特异性;在定量检测中,可实现一个标准分子对应13种靶标的精准测定。因此,该研究创制的质粒标准分子pUC57-SOY可作为转基因大豆检测的阳性对照品。

一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。

沙眼衣原体质粒编码蛋白3的致病性及免疫保护性研究

目的 探索沙眼衣原体(CT)质粒编码蛋白3(Pgp3)的致病性及免疫保护性。方法 CT L2构建株(GFP)、野生株(WT)和质粒缺失株(PF)分别感染Hela细胞,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)和间接免疫荧光法(IFA)检测Pgp3蛋白表达水平;L2 GFP、WT和PF菌株经阴道分别感染C3H小鼠,感染后不同时间点经IFA评估生殖道包涵体形成单位(IFU)数量;组氨酸标记的Pgp3(His-Pgp3)体外刺激人输卵管上皮细胞,24 h后经Hoechst 33 528染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况;L2 WT体外感染L929和L929-Pgp3细胞,在感染后30、60及80 h固定细胞并计算IFU和细胞核数量。L2 GFP和WT菌株经阴道分别感染C3H小鼠,50 d后各组均以L2 WT菌株攻毒,攻毒后不同时间点评估生殖道IFU数量。结果 L2 GFP Pgp3蛋白表达水平高于L2 WT,L2 PF无Pgp3蛋白表达;小鼠感染后第3、7、10和14天,L2 GFP感染组IFU数量显著高于L2 WT和L2 PF感染组,且L2 GFP组感染周期最长;Pgp3体外干预组细胞凋亡率显著低于空白组,L2 WT体外感染L929和L929-Pgp3细胞60 h和80 h后,L929-Pgp3组IFU值显著高于L929组,且宿主细胞消亡数量显著低于L929组;动物实验显示L2 GFP组经L2 WT菌株攻毒后下生殖道IFU数量显著低于L2 WT组,且L2 GFP组感染周期显著短于L2 WT组。结论 Pgp3可抑制宿主细胞凋亡并促进CT在细胞间播散感染;内源性Pgp3有良好的免疫保护性。

黄芩消除产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药质粒的研究

目的研究中药黄芩对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae,CRKP)的抑菌及质粒消除作用。方法用肉汤稀释法测得黄芩、亚胺培南对CRKP的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);用质粒消除试验测定黄芩对CRKP的质粒消除率;用质谱检测系统对质粒消除菌株的菌种进行鉴定,用K-B纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauerdiscagar diffusion method,K-B法)确认消除子对亚胺培南、美罗培南的敏感性,用碳青霉烯灭活试验/乙二胺四乙酸碳青霉烯灭活试验(mCIM/eCIM)确认消除子是否产碳青霉烯酶,用聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测消除子是否携带blaKPC基因。结果黄芩对CRKP的MIC值为6.25mg/mL,在24、48、72h的质粒消除率分别为0%、0.3%、1%;消除子经全自动微生物质谱检测系统鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN),对亚胺培南、美罗培南敏感,mCIM/eCIM实验阴性,PCR未检测到blaKPC基因。结论黄芩对CRKP有一定的抑菌作用及质粒消除作用。

亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的促进作用

为了分析亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的影响,本试验建立了以大肠杆菌(E.coli)J53作为受体菌,携带RP4-7质粒的E.coli DH5α和携带mcr-1阳性IncI2质粒的临床菌株E.coli LD67-1为供体菌的接合转移模型,测定亚抑菌浓度的万古霉素对接合转移的影响,并通过细胞膜通透性检测、扫描电子显微镜观察、活性氧(ROS)检测和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法探究其内在机制。结果显示,与空白对照组相比,亚抑菌浓度万古霉素可显著提高RP4-7质粒和mcr-1阳性IncI2质粒的接合转移频率(P<0.05);N-苯基-1-萘胺(NPN)和碘化丙啶(PI)探针检测显示,亚抑菌浓度万古霉素可使受体菌细胞内、外膜通透性增加,供体菌细胞外膜通透性增加;扫描电子显微镜观察显示,经1/4最小抑菌浓度(MIC)万古霉素处理后接合细菌细胞膜发生损伤;ROS检测结果显示,与空白对照组相比,虽然经1/4 MIC万古霉素处理的受体菌的ROS表达水平显著上调(P<0.05),但1/8 MIC万古霉素处理后,供体菌和受体菌的ROS水平均无显著变化(P>0.05);RT-qPCR结果显示,与空白对照组相比,亚抑菌浓度万古霉素显著上调了供体菌和受体菌的孔蛋白基因ompF和ompC的mRNA表达水平(P<0.05),极显著上调了trbBp基因(调控细菌间形成“连接桥”)的mRNA表达水平(P<0.01),显著上调了细菌SOS响应(SOS response)相关基因recA、recN、ruvA和lexA的mRNA表达水平(P<0.05)。结果表明,亚抑菌浓度的万古霉素可能通过提高细菌细胞膜通透性,触发SOS响应,促进接合转移“连接桥”形成等方式促进RP4-7质粒和mcr-1阳性IncI2质粒的接合转移过程。

ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究

目的探讨肺炎克雷伯菌QL5株携带编码碳青霉烯酶基因的质粒及其特性。方法基于二代Illumina和三代Nanopore测序技术平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用一系列软件分析菌株的生物学信息。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳、质粒液相接合试验和稳定性试验检测菌株携带的质粒特性。结果生信分析显示:肺炎克雷伯菌QL5株携带的bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上(命名为pQL5-NDM-KPC);QL5株携带的pQL5-NDM-KPC可发生bla_(NDM-1)基因所在区域的片段丢失。结论经检索,携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒pQL5-NDM-KPC(GenBank序列号:OR253888)上,为国内外首次报道。

质粒介导的水产食品源多重耐药副溶血性弧菌耐药性传播机制的研究

为研究水产食品源副溶血性弧菌的多重耐药情况以及质粒介导其多重耐药的传播机制,本研究采购太平洋鲭鱼、凡纳滨对虾和太平洋牡蛎等水产食品样品共计300份,经传统培养法、PCR法、革兰氏染色法、生化鉴定、16S rRNA基因的PCR扩增与测序分析,分离并鉴定分离的副溶血性弧菌,利用PCR法分析分离菌株携带的耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血毒素相关基因(trh),采用K-B药敏纸片扩散法检测分离菌株对9类共19种药物的耐药性并分析其的多重耐药性,通过SDS法质粒消除试验、质粒提取及分型试验和质粒接合转移试验研究质粒介导的多重耐药副溶血性弧菌耐药性的传播情况。结果显示:300份水产食品中共分离鉴定到95株副溶血性弧菌,分离率为31.7%(95/300);未检出tdh和trh毒力基因;药敏试验结果显示,有30.5%(29/95)的分离菌株具有多重耐药性且分离菌株主要对氨苄青霉素和利福平耐药。对29株多重耐药分离菌株进行质粒消除试验后,发现有15株发生全部或部分耐药表型消失现象;对该15株分离菌株提取质粒并分型,其中13株分离菌株携带IncF型质粒;对10株质粒携带氨苄青霉素抗性的分离菌株进行接合转移试验,并采用K-B法检测结合子的耐药性及耐药性的稳定性。结果显示10株分离菌株均携带具有接合转移能力的质粒且其对氨苄青霉素和利福平的耐药性均稳定。综上所述,本研究从水产食品中分离到的副溶血性弧菌且均不含tdh和trh毒力基因,因此分离菌株的致病性低,但多重耐药率较高,其中多重耐药副溶血性弧菌中耐药质粒的携带率为51.7%(15/29),其以耐药质粒为载体的水平传播可能由IncF型质粒主导。本研究为规范水产养殖用药、阻断水产食品源耐药微生物的传播扩散奠定一定的实验基础。

鸡球虫病7价多表位嵌合重组抗原ET seven真核质粒的构建、表达及其初步功能分析

为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其免疫功能。本研究利用生信分析获得7个抗原表位,分别提取柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体总RNA,通过RT-PCR扩增获得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7个抗原的表位区域编码基因,构建基因图谱由公司合成以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven;将鉴定阳性、测序正确的质粒pcDNA3.1-ET seven转染至DF-1细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测ET seven重组基因片段在DF-1细胞中的表达;以磷酸钙纳米颗粒作为辅助质粒递送佐剂检测pcDNA3.1-ET seven在鸡体内引起的细胞因子水平变化,间接ELISA检测特异性IgG抗体水平。结果显示:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven,RT-PCR和Western blot检测到ET seven的特异性表达,质粒通过磷酸钙纳米佐剂免疫鸡体后,检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表达,其中CD-40与IL-6的表达水平最高。pcDNA3.1-ET seven重组质粒结合磷酸钙佐剂肌肉注射二次免疫后7 d间接ELISA检测特异性IgG抗体呈阳性。结果表明,pcDNA3.1-ET seven重组质粒构建成功,在鸡体内有良好的免疫原性,为鸡球虫病的疫苗防控提供新的思路和技术支撑。

沙门氏菌耐药与毒力杂合质粒的分子特征与转移风险研究进展

沙门氏菌是引发食物中毒的首要致病细菌,其高毒耐药流行株在食品安全研究领域受到广泛关注。这些高毒耐药株中常携带耐药与毒力基因杂合质粒及大量可移动元件,它们可通过整个食品产业链进行水平转移,给民众的餐桌安全和身体健康带来巨大危害。深入解析这些质粒中耐药与毒力基因杂合转移的分子特征及其转移风险,是研究食源性致病菌危害因子传播规律领域的一个重要问题。伴随着测序技术的进步,耐药与毒力基因在质粒中的聚集与重组等演化过程逐渐被揭示,可移动元件在质粒的稳定和转移过程中的作用也得到初步验证。基于此,本文从杂合方式与转移风险、重要可移动元件的功能以及杂合质粒中耐药与毒力基因的演化特征等角度,简述沙门氏菌耐药与毒力杂合质粒的研究进展,以期为揭示高毒耐药株的传播特征和风险评估提供数据支持。

首次从湖南猪源大肠杆菌中检出mcr-1阳性IncI2(Delta)质粒

近年来,由于抗生素耐药基因的广泛传播及多重耐药细菌的出现,导致抗生素的使用面临严峻挑战,致使毒性较强的多黏菌素又重新引起业界的重视,为此对多黏菌素耐药情况的研究也变得十分重要。为了调查畜牧场中多黏菌素耐药基因mcr-1的流行情况,本研究选择我国湖南省某猪场240份肠肛拭子样品,培养分离鉴定出含有mcr-1耐药基因的大肠杆菌菌株,选取多黏菌素等10种抗菌药物对分离的菌株进行耐药性试验,对所有含mcr-1耐药基因的大肠杆菌阳性株进行全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS),采用多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)技术进行大肠杆菌的遗传多样性分析。研究结果表明,在分离出的172株大肠杆菌中,来自不同个体的9株携带mcr-1基因的大肠杆菌均表现出多重耐药现象;MLST分析共鉴定出ST10、ST196、ST46和ST5229共4种分型和4种血清型(O83:H5,O16:H7,O16:H51,O9:H4)。生物信息学分析显示,所有阳性菌株均未发现与mcr-1基因传播有关的典型可移动遗传元件ISApl1,但均检出可能会导致mcr-1传播的IV型分泌系统基因。质粒接合转移试验与单倍型的MLST多态性结果表明,mcr-1基因主要以质粒介导的水平传播为主。本研究是国际上首次在猪源细菌中检出常见于人医临床细菌的携带有mcr-1抗性基因的IncI2(Delta)质粒。

鸭疫里默氏杆菌菌影的制备及其与CpG质粒联用的免疫效果评价

为了制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)菌影并探究其与CpG质粒联用的口服免疫效果,试验用NaOH将RAGD1904-2菌株制备成RA菌影,用扫描电镜检测菌影形态,将制备成功的RA菌影与CpG质粒联合应用。将80只1日龄的健康樱桃谷鸭随机分为对照组、高剂量RA菌影组(接种菌影1×10^(10) cfu)、低剂量RA菌影组(接种菌影1×10^(9 )cfu)、CpG+低剂量RA菌影组(CpG质粒50μg+接种菌影1×10^(9 )cfu),每组20只,分别在5日龄及14日龄进行口服免疫,每日1次,连续3 d;于28日龄采集各组鸭外周血并检测血清IgG、IgA、IL-2、IL-6含量;以1×10^(7.39) cfu(半数致死量)的RAGD1904-2菌株进行攻毒,攻毒后连续观察7 d,统计发病率及死亡率。结果表明:各免疫组血清IgG、IgA、IL-2、IL-6含量均极显著高于对照组(P<0.01),且CpG+低剂量RA菌影组血清IgG、IgA含量均极显著高于高剂量RA菌影组和低剂量RA菌影组(P<0.01);CpG+低剂量RA菌影组IL-2含量显著高于低剂量RA菌影组(P<0.05),IL-6含量极显著高于低剂量RA菌影组(P<0.01);高剂量RA菌影组血清IgG、IgA含量显著高于低剂量RA菌影组(P<0.05)。高剂量RA菌影组和低剂量RA菌影组发病率均高于50%,CpG+低剂量RA菌影组发病率为35%,死亡率仅为20%。说明RA菌影与CpG质粒的联合应用可以有效降低RA感染的发病率和死亡率,提高血清IgG、IgA、IL-2、IL-6含量。

基质粒径与植株密度对人工湿地净化渗滤液荧光及微生物特性的影响

为了揭示基质粒径、植株密度对人工湿地净化垃圾渗滤液有机物效果的影响,以陶粒、黄菖蒲为试验材料,构建了粒径20 mm+植株密度50株/m^(2)(K1)、粒径20 mm+植株密度75株/m^(2)(K2)、粒径5 mm+植株密度50株/m^(2)(K3)3个人工湿地处理系统,采用三维荧光和变性梯度凝胶电泳技术对其进行分析。结果表明,溶解性有机物(DOM)去除率、荧光强度、微生物多样性及结构粒径间K1与K3差异显著,不同植株密度间K1与K2之间荧光强度、微生物多样性差异显著。粒径变小可显著提高有机物净化,经过21天净化后,K3对DOM的去除率比K1高出29.72%(P<0.05),荧光强度下降5.04(P<0.01),粒径对微生物结构变化影响的贡献率高达57%(P=0.048);植株密度亦可促进有机物去除,显著增加微生物多样性与结构,K2相比K1 f450/500降幅达0.72。表明在应用人工湿地净化垃圾渗滤液时,可通过降低粒径基质与提高密度植株的方式,提升系统微生物丰度及结构多样性,促进有机污染物的去除。

猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。

调控质粒拷贝数优化生物催化效率的研究进展

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质粒复制机制,开发出了许多性能更优异的新质粒系统,显著提高了生物催化效率。该文结合质粒拷贝数在多种微生物细胞工厂中的应用进行综述,以期为合成生物学领域的相关研究提供参考和借鉴。

pDNA质粒在一次性生物反应器中的放大生产研究

【目的】探索大肠杆菌(E.coli)菌种复苏后跳过三角摇瓶直接接种一次性WAVE生物反应器进行菌种扩增,并放大至一次性XDR生物反应器进行质粒放大生产的可行性,建立GMP级质粒在全一次性上游平台进行工业化放大生产的工艺。【方法】通过碳氮比优化,筛选并获得不含任何动物源成分的基础培养基和补料培养基;菌种冻存管室温融化后以低密度接种三角摇瓶和WAVE反应器,考查菌种低密度接种的可行性,比较三角摇瓶和WAVE反应器进行菌种扩增的差异,建立菌种在WAVE反应器中的扩增工艺;随后将菌种扩增至50LXDR生物反应器进行质粒的放大生产。【结果】与LB培养基相比,优化的不含任何动物源成分的基础培养基使菌体最高密度和质粒产量分别提高43%和77%;以1∶1000-1∶8000低密度接种WAVE反应器,菌种比生长速率达到(0.65±0.065)/h,WAVE反应器展现了更好的过程参数控制,通过一级WAVE种子罐可直接为50-200 L生产罐提供种子细胞;质粒在一次性50LXDR反应器中的放大生产,最高菌体密度和质粒产量分别达到53OD和340mg/L,质粒比生产速率达到6.42 mg/L/OD_(600),比常规质粒比生产速率提高2倍以上,超螺旋质粒比例达到90%,较高的上游收获超螺旋比例为下游质粒两步层析纯化提供了可能。【结论】建立了大肠杆菌通过WAVE反应器进行菌种扩增,通过一级种子罐直接接种生产罐进行质粒放大生产的工艺,为GMP级别质粒在50-200L一次性生产平台中的放大生产建立了生产工艺。

β淀粉样蛋白_(1-42)质粒的构建及其与钙调蛋白的结合作用

目的探讨β淀粉样蛋白_(1-42)(Aβ_(1-42))与钙调蛋白(CaM)的结合作用。方法采用生物信息学方法获取阿尔茨海默病(AD)异常表达的核心基因,预测AD防治的潜在靶蛋白;通过基因重组的方法构建GST-Aβ_(1-42)重组质粒并进行DNA测序;琼脂糖凝胶电泳进行重组质粒的酶切鉴定;提取纯化GST-Aβ_(1-42)融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否纯化成功;GST pull-down检测质粒表达的GST-Aβ_(1-42)蛋白与CaM的结合作用。结果获取连接度排名前20的核心基因,将CaM作为靶蛋白;质粒的DNA测序结果证明重组质粒构建成功,琼脂糖凝胶电泳结果显示,酶切后的片段与Aβ_(1-42)片段分子量大小理论值符合,进一步证明重组质粒构建成功;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示GST-Aβ_(1-42)蛋白能够与CaM结合,并具有浓度依赖性。结论Aβ_(1-42)重组质粒构建成功,且与CaM具有结合作用。