细胞周期蛋白C基因克隆与重组质粒pCMV-tag2B-CCNC的构建与鉴定

[目的]克隆人细胞周期蛋白C基因(human cyclin C,CCNC),构建真核表达载体,诱导并鉴定其表达。[方法]利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以急性淋巴细胞性白血病细胞株6T-CEM mRNA为模板,扩增CCNC基因,将克隆获得的CCNC全长cDNA片段构建重组表达载体pCMV-tag2B-CCNC,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染至6T-CEM细胞系,诱导其表达,Western Blot鉴定其表达。[结果]电泳获得944bp预期序列,pCMV-tag2B-CCNC经双酶切鉴定及序列分析证实为正确的有完整读码框的CCNC基因,将pCMV-tag2B-Sorcin导入6T-CEM细胞并成功表达,目的蛋白经Western blot鉴定具有生物学活性。[结论]经测序及酶切鉴定,成功克隆了CCNC的cDNA,并成功构建了CCNC真核表达质粒pCMV-tag2B-CCNC,重组质粒能表达具有生物学活性的CCNC蛋白,为研究CCNC的功能打下了基础。

pCMV-tag2A/NAP1融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

从含有目的基因的cDNA克隆中,利用PCR方法钓取目的基因.将目的基因与酶切线性化的载体进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞.采用菌落PCR方法和核酸序列测定进行阳性克隆鉴定.对构建好的pCMV-tag2A/NAP1融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提.

人Notch受体胞内区基因N2ICD克隆及真核表达

目的构建真核重组质粒N2ICD/p CMV-Tag4并转染HEK 293T细胞进行表达。方法根据GenBank上Notch2的NICD序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人宫颈癌细胞Hela细胞扩增人Notch2受体胞内区基因(N2ICD),酶切和测序鉴定后克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4并进行瞬时和稳定转染HEK 293T细胞,荧光定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹(WB)检测目的蛋白的表达。结果通过RT-PCR克隆获得人N2ICD基因并成功构建重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4,目的蛋白N2ICD在HEK 293T细胞中获得表达。结论成功构建稳定表达N2ICD的HEK 293T细胞株,为进一步探讨Notch2受体的功能奠定基础。