重组质粒pCR3.1-brZPC’的构建及其体内外表达

目的 构建重组质粒 pCR3 .1 brZPC’ ,检验其在细胞及动物体内的表达。 方法 应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)法克隆基因 ,与真核表达载体pCR3 .1相连 ,转化感受态菌后酶切鉴定重组质粒。脂质体法转染Hela细胞 ,RT PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA水平的表达 ;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白水平的表达。接种BALB/c小鼠 ,一周后提取其各组织的总RNA ,RT PCR检测重组质粒在被免疫动物体内mRNA水平的表达情况。 结果 重组质粒 pCR3 .1 brZPC’能在细胞和被免疫动物体内高效表达。被免疫动物可以产生相应的抗体 ,且与该重组蛋白在细胞外结合。 结论 重组质粒 pCR3 .1

pCR3.1-bvLDH-C′_4的构建及在体内外的表达

精子特异性乳酸脱氢酶 (LDH C4)在精子的运动和存活等生理活动中起着重要的作用。研究表明 ,LDH C4接种鼠、兔等能够降低动物的生育率。通过RT PCR方法从布氏田鼠睾丸总RNA中克隆出编码抗原决定簇的LDH C4基因片断 ;采用T A克隆的方法将其插入到pCR3 1载体中构建重组载体pCR3 1 bvLDH C′4,测序结果表明克隆的基因片断与已知小鼠相应片断有 83 %的序列同源。通过质脂体法转染HeLa细胞 ,RT PCR证实其可在mRNA水平有效表达 ;通过肌肉接种BALB c小鼠 ,RT

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的细胞免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的小鼠细胞免疫应答。方法将真核重组表达质粒pcDNA3.1-TSO45-4B肌注小鼠,RT-PCR方法扩增出目的条带;ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ含量。结果RT-PCR产物为单一条带,大小为456bp,与TSO45-4B大小一致。免疫小鼠第2周细胞因子含量达到较高水平,第4周达到最高水平,第8周开始下降。结论基于猪囊尾蚴保护性抗原TSO45-4B的DNA疫苗能在小鼠体内表达并有效诱导细胞免疫效应。

人β地中海贫血突变基因重组载体pcDNA3.1-LCR-β^(41/42)的构建

目的构建人β地中海贫血突变基因β41 /42及具有调控功能的基因座控制区(LCR)重组载体,为该病基因治疗的体外细胞模型和转基因小鼠模型的建立奠定基础。方法抽提β41 /42纯合子患者的DNA,PCR扩增人β珠蛋白基因座控制区 (LCR)和β41 /42基因,将其串联克隆至pcDNA3. 1 中,酶切及测序鉴定重组载体。结果所构建的重组载体中含人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β41 /42基因,测序结果及引入方向正确。结论成功构建了含 5. 5kgβ珠蛋白基因座控制区(LCR)的β41 /42人重型地中海贫血基因的重组载体。

大鼠PDZ1-FLAG的亚克隆及pcDNA3.1载体的构建

目的亚克隆大鼠PDZ1-FLAG基因片段并构建pcDNA3.1载体。方法以pAdTrack-CMV-PDZ1为模板,采用PCR法获得PDZ1-FLAG的双链DNA;与pcDNA3.1载体用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①得到了PDZ1-FLAG的双链DNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1-FLAG和pcDNA3.1两条带;③PDZ1-FLAG测序图谱与文献报道完全一致。结论获得了含目的基因PDZ1-FLAG的pcDNA3.1载体。

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术，即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列，然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中，以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定，确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。

BrVIN3.1互作蛋白BrZAT12在大白菜春化途径中行使功能初探

BrVIN3.1在春化过程中通过调控BrFLC1的表观修饰状态,进而调控其表达控制大白菜花期。本试验以BrVIN3.1(Bra020445)为诱饵,进行酵母cDNA文库筛选,从中筛选到它的互作蛋白BrZAT12(Bra006691);进一步进行酵母双杂一对一验证,证明BrZAT12能够与BrVIN3.1互作。采用低温处理不同花期的大白菜材料,进行表达模式分析,发现BrZAT12的表达模式在抽薹性状不同的大白菜材料中存在差异,在易抽薹材料中的表达量明显高于耐抽薹材料,且在耐抽薹材料中变化幅度较小,同时BrZAT12的表达模式与BrVIN3.1相关。推测BrZAT12可能在大白菜春化调控的开花途径中行使功能。

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体。方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)两者多克隆位点的特点,选用pGEMR○-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。结论:具有不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体业已成功构建。

Aβ_(1-15)多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

【目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.1表达载体,构建pcDNA3.1-s4×Aβ15真核表达质粒;质粒转染COS-7细胞,Westernblot检测4×Aβ15的表达;质粒肌肉注射接种BALB/c鼠,共6次,18周加强免疫,ELISA法检测抗体效价以及抗体分型;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15载体序列正确,在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4×Aβ15蛋白。pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体,随加强免疫次数增多,抗体滴度增加,在19周,抗体平均滴度为1︰6400,抗体以IgG1型为主,且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体,为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。

肿瘤相关未知功能基因MGC39325的克隆及生物信息学分析

目的:克隆与肿瘤恶性演进相关但未知功能的新基因MGC39325,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其功能.方法:应用RT-PCR技术从LoVo细胞中扩增MGC39325基因全长ORF,选用pGEM-T载体进行TA克隆,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)的启动子和终止子之间,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定.应用生物信息学初步分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能.结果:从LoVo细胞中扩增出1158bp的cDNA,成功进行TA克隆并进一步亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,测序证实为人MGC39325基因.生物信息学分析显示此基因定位于8q12.1,含有2个外显子(1113bp),DNA序列含有表皮样生长因子位点标记(3-14,12-23)、整合素beta链半胱氨酸富集区位点标记(183-196)、铁氧化还原蛋白铁硫结合区位点标记(389-397,1027-1038)、第Ⅷ因子结构域位点标记(105-157,548-591)、羧基端胱氨酸结位点标记(744-782)等,编码由370个氨基酸组成蛋白质,Mr40727.9,pI值为9.45,疏水性平均值为-0.668,含3个低复杂性区域结构,氨基酸序列含有豆蔻酰化位点(19-24,130-135)、cAMP和cGMP4&赖性蛋白激酶(38-41,46-49,204-207)、酪蛋白激酶(49-52,158-161)、酪氨酸激酶(53-61)、蛋白激酶C磷酸化位点(97-99,140-142,208-210)、N-糖基化位点(97-99)等结构域,提示这一新的蛋白质可能在细胞生长、黏附及细胞信号转导方面具有重要功能.结论:成功地克隆了人MGC39325基因全长ORF,构建了其pcDNA3.1(+)真核表达栽体,为进一步研究其功能及其肿瘤中的作用创造了条件.

hSAMP32基因疫苗的构建及对小鼠生育的影响

目的构建hSAMP32避孕疫苗,研究其对小鼠生育率的影响。方法扩增hSAMP32基因片段;hSAMP32基因测序;重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建;观察BALB/c小鼠生殖能力是否受到影响。结果经对比,目的基因组较对照组穿卵率明显下降。结论 hSAMP32基因可以降低BALB/c小鼠的生殖能力。

肿瘤相关线粒体蛋白12对移植瘤细胞增殖的影响

目的探讨肿瘤相关线粒体蛋白12（TAMP12）对小鼠移植瘤细胞增殖的影响。方法采用脂质体法将TAMP12基因及空载体转染肝癌细胞系SMMC-7721，经G418筛选获得稳定高表达TAMP12细胞株（SMMC-7721-TAMP12）及对照细胞（SMMC-7721-pcDNA3.1），实时定量PCR和蛋白印迹检测TAMP12在这两组细胞中的表达。将SMMC-7721-TAMP12和对照SMMC-7721、SMMC-7721-pcDNA3．1三组细胞分别接种于BALB／C^nu/nu小鼠的前肢腋下，连续观察荷瘤小鼠中肿瘤的生长状况。接种4周后处死小鼠，取瘤块分别测量瘤体质量和体积，应用实时定量PCR和免疫组化方法检测三组移植瘤中TAMP12的表达：透射电镜观察移植瘤细胞中亚细胞器形态；并应用基因芯片技术检测三组移植瘤肿瘤细胞中的基因差异表达。结果将经实时定量PCR和蛋白印迹检测显示高表达TAMP12的SMMC-7721和对照细胞分别接种裸鼠后，三组荷瘤小鼠中肿瘤的生长曲线呈现明显差异，转染TAMP12的荷瘤小鼠中肿瘤生长速度明显快于对照组荷瘤小鼠。肉眼以察可见实验组肿瘤组织中血管较对照组丰富；电镜观察发现实验组的细胞分裂增殖明显。基因芯片显示，该基因的高表达可促进多个与细胞增殖相关的基因表达上调。结论TAMP12基因具有促进细胞增殖的作用，其机制可能与调节细胞增殖的胰岛素样受体介导的信号转导通路有关。

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1(+)中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1(+)/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+)/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。

Dpc4基因转染胰腺癌细胞株对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响

目的探讨Dpc4基因转染胰腺癌细胞株HS766T对裸鼠移植瘤生长的影响。方法按pcDNA3．1-DOe4是否转染人胰腺癌细胞株HS766T将细胞分为pcDNA3．1-Dpc4转染组、pcDNA3．1空载体组和未转染组，RT—PCR鉴定目的基因的表达；将3组细胞分别接种于裸鼠，比较Dpc4基因对裸鼠胰腺癌移植瘤的生长抑制作用，

定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力

应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶(PtLic16A)在酸性条件下的催化能力。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了β-葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系。筛选得到的突变酶PtLic16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活。突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G。结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用。