非洲猪瘟病毒RNA聚合酶亚基D205R基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pD205R蛋白参与病毒基因的转录,属于ASFV RNA聚合酶,且与真核生物RNA聚合酶II RPB5亚基相似,为深入了解pD205R结构,功能及病毒与宿主之间的作用机制。利用DNAStar、MEGA7.0对GenBank中公布的不同毒株的ASFV D205R基因序列进行分析,利用ExPASy、GOR4、AlphaFold软件对该蛋白的理化性质及结构预测进行分析,并对其原核表达和制备抗pD205R蛋白多克隆抗体。结果显示:在不同基因型间D205R基因高度保守;利用ExPASy在线软件预测pD205R蛋白理化性质其分子式为C_(1088)H_(1712)N_(278)O_(295)S_(8),属亲水性蛋白,稳定性差;二级结构及三级结构预测显示,α螺旋是其主要结构形式,占比为35.12%;同时以ASFV-CN/SC/2019毒株基因组为模板,构建原核表达质粒pET-28a-D205R并转入Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导重组蛋白成功表达,大小为23.3 ku。获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,Western blot鉴定可与ASFV阳性血清发生特异性反应。免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶51200,Western blot和IFA结果显示制备的多克隆抗体够特异性的识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的天然pD205R蛋白,为进一步研究D205R基因的功能及其在宿主与病毒互作中的作用奠定了基础。