CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达

目的:为了检测扩增所得CMV启动子能够指导下游基因序列表达,从而可以为构建其它真核表达载体提供实验基础和依据。方法:对pEGFP质粒上的CMV启动子进行扩增,并将其插入pDsRed2-1质粒红色荧光蛋白上游,构建pCMV-Red质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞,对其进行荧光检测。结果:质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞48h后,荧光激发细胞,发红色荧光。结论:扩增所得CMV启动子具有启动其下游基因表达的功能。pCMV-Red质粒可用于构建其它真核表达载体。

重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定

目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。

质粒转染对HEK293和DDT1-MF2细胞天然β2-肾上腺素受体表达的影响

目的 :观察质粒转染对细胞天然 β2 肾上腺素受体 (β2 AR)表达量的影响。方法 :将不携带外源目的基因的 pREP4质粒和携带α1B AR或 β1 ARcDNA的 pREP4质粒 ,采用脂质体和磷酸钙沉淀法转染HEK2 93和DDT1 MF2细胞。结果 :相同质粒载体 ,无论有无外源目的基因 ,或目的基因是否相同 ,均可使HEK2 93细胞天然表达的β2 AR密度及其介导的cAMP蓄积效应增加。而用同样方法在DDT1 MF2细胞转染 pREP4质粒则对 β2 AR表达无影响。结论 :转染携带或不携带目的基因的质粒对HEK2 93细胞天然表达 β2 AR的密度及其介导的功能效应均有影响 ,且提示这种效应可能具有细胞特异性。

稳定高表达TGF-β_1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株。方法利用RNA干扰技术提取p EGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了p EGFP-TGF-β1质粒和p EGFP对照质粒的细胞株分为p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组。结果 p EGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%。RT-PCR结果显示,p EGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1m RNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,p EGFPTGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015)。结论本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究。

致密斑细胞COX-2的表达及AP-1、NFκB信号通路

目的评估低盐(LS)培养对小鼠致密斑(MMDD1)细胞环氧化酶-2(COX-2)表达及核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)活性的影响。方法经脂质体转染含NF-κB或AP-1的报告质粒,采用瞬时表达方法检测正常盐(NS)与LS培养对NF-κB和AP-1转录活性的影响。采用RT-PCR检测MMDD1细胞COX-2表达的变化,Westernblot方法检测细胞内p-p38MAPK、p-p44/42、c-Jun、c-Fos和COX-2蛋白的表达。结果LS培养促进了MMDD1细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。LS培养后,p38和p44/42的磷酸化程度显著上调(P<0.01),180min后达到高峰。p38抑制剂SB-203580、p44/42抑制剂PD-98059可降低LS诱导的COX-2表达(P<0.01)。LS培养促进了c-Jun、c-Fos蛋白表达(P<0.01),激活了AP-1和NF-κB的转录活性(P<0.01)。25μmol/LNF-κB抑制剂PDTC和20μmol/LAP-1抑制剂curcumin下调了LS诱导的NF-κB、AP-1活性(P<0.01)。25μmol/LPDTC、20μmol/Lcurcumin降低了LS诱导的COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论LS培养可促进MMDD1细胞COX-2的表达,其作用可能与促进p38MAPK、p44/42激酶的磷酸化,增加NF-κB和AP-1的活性有关。

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达。方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4DNALigase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP。重组质粒经酶切及测序鉴定。将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果。结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达。结论:成功构建真核表达质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制。

pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的导入对减毒沙门菌生物学行为的影响

目的探讨真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入对减毒鼠伤寒沙门菌SL3261生物学行为的影响。方法将真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL通过两步电转化获得含pIRES2-EGFP质粒的SL3261,接种于LB培养基中观察其生长特性、革兰染色观察其形态和血清凝集试验检测其表面抗原变化。利用该重组菌体外感染HepG2细胞,观察其对细胞的侵袭能力的影响。结果含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261在体外生长繁殖较原细菌慢,革兰染色呈阴性丝状菌体,含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261 A-F多价、O4菌体和H1鞭毛抗原和SL3261完全一致;体外感染HepG2能力,SL3261为201±46 CFU/200HepG2细胞,SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,3组间的差异无统计意义(P>0.05)。结论导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒对SL3261的生长和形态有部分影响,而表面抗原以及侵入HepG2细胞的功能不变,该结果为含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261疫苗菌的进一步研究奠定了实验依据。

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。

功能化Fe_3O_4的制备及在基因转染中的应用

目的探讨修饰了多聚赖氨酸的超顺磁性葡聚糖Fe3O4纳米粒子(简称功能化Fe3O4,DMNP)的制备及其作为基因载体的可行性。方法采用碱沉淀法一步合成了外包葡聚糖的磁性纳米粒子,并用多聚赖氨酸对其表面进行修饰,使之通过静电作用吸附连接DNA。同时应用扫描电镜、红外分光光度计对该纳米复合物的结构及成分进行表征,并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对其结合质粒DNA的能力进行测量,该复合纳米粒子作为基因载体将绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1转入人肺癌细胞系A549中,并进一步将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人肺癌细胞系A549中。结果该复合纳米粒子分散性好,大小较均一,与质粒DNA有较好的结合能力,用荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白的表达,并用PCR技术检测到了耐药基因ABCG2的表达。结论该复合纳米粒子能作为一种新型有效的基因载体在体外将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人肺癌细胞系A549中并表达。

LIM矿化蛋白-1与LIM矿化蛋白-3共转染骨髓间充质干细胞的基因表达

目的探讨LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein,LMP)-1和LMP-3双基因共转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)的表达情况。方法采用人工设计合成人LMP-1和LMP-3基因片段,分别与质粒pEGFP-N2连接,经酶切、测序鉴定后。分离培养新西兰兔BMSC,用脂质体包裹转染BMSC,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、LMP-1与LMP-3双基因共转染组(E组)。采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法检测LMP-1和LMP-3的表达。结果酶切及测序表明真核表达质粒pEGFP-N2-LMP-1和pEGFP-N2-LMP-3构建成功。E组可同时较高水平表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及蛋白质印迹法检测结果行灰度值测量并行统计学分析显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),但E组与C组的差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),且E组与D组差异也有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共转染的BMSC能在体外同时表达LMP-1与LMP-3,为基因修复骨缺损带来新思路。

蛋白酶体激活因子REGγ的重组表达及其体外功能的初步探讨

目的蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物γ亚单位(11S regulator complex gamma subunit,REGγ)的重组表达,初步探讨其与骨形成负调控分子酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1(caseinkinase-2interactingprotein-1,CK-IP-1)的相互作用。方法首先以质粒pCMV-Myc-REGγ为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出765bp的REGγcDNA片段,然后亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-2并转化入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,表达产物超声破碎后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定,进而通过GSTPull-down实验验证REGγ是否与CKIP-1存在相互作用。结果通过测序证实原核表达载体pGEX-4T-2-REGγ构建成功,进一步表达鉴定发现GST-REGγ蛋白主要以可溶性的形式存在于裂解上清中;GSTPull-down实验表明REGγ与CKIP-1存在明显的相互作用。结论REGγ与CKIP-1在体外存在相互作用,为进一步深入研究REGγ对CKIP-1的调控作用奠定了基础。