猪表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及其生物活性研究

【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转至乳酸乳球菌NZ3900,以LacF为筛选标记获得重组菌pEGF-NZ。用nisin诱导重组菌pEGF-NZ表达重组蛋白pEGF,并通过Tricine-SDS-PAGE检测其表达情况。改良实验室及工业发酵条件以提高pEGF表达量。利用猪回肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖试验体外验证表达的pEGF生物活性。通过动物试验验证重组蛋白pEGF对小鼠及断奶仔猪腹泻的影响。【结果】试验成功构建重组菌pEGF-NZ,并分泌表达pEGF蛋白。体外试验结果显示,pEGF蛋白能促进细胞增殖。pEGF-NZ重组菌及其表达的pEGF蛋白能延缓小鼠腹泻发生时间,降低腹泻率,保护小鼠肠绒毛的完整性。与对照组相比,pEGF-NZ重组菌处理后,小鼠结肠中乳酸菌数显著增加(P<0.05),大肠杆菌数、肠球菌数显著降低(P<0.05),白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β含量显著降低(P<0.05),IL-13含量显著升高(P<0.05)。饲粮中添加pEGF-NZ重组菌后,断奶仔猪腹泻情况明显缓解,平均日增重有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。【结论】pEGF-NZ重组菌及其分泌表达的pEGF能够修复肠道屏障,抑制病原菌黏附,调控肠道菌群,其主要通过下调部分促炎因子、上调抑炎因子表达发挥抑炎效果,从而保护断奶仔猪肠道健康,有效缓解腹泻。

枯草芽孢杆菌表达载体的构建及猪源表皮生长因子的表达

本文首先以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)穿梭载体pDG150为基础,构建了含有5个克隆位点的表达载体pTD160,并在此基础上构建了带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体pTD161和可用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG融合表达的表面展示载体pTD162。将脂肪酶基因lipa分别插入pTD161和pTD162,在B.subtilis 168中表达,其LipA酶活性分别为23.4U/mg和15.3U/mg,表明pTD载体具有良好的表达性能。通过无抗生素压力传代培养10代后,发现其稳定性仍为96.5%和95.0%,证明pTD载体具备较高的稳定性。将密码子优化后的猪源表皮生长因子基因pegf分别导入pTD161和pTD162,转化B.subtilis 168获得工程菌Bs168-pTD161-pegf和Bs168-pTD162-pegf,ELISA法证明pEGF在工程菌中表达量分别达到365ng/mL和285ng/mL,证明pEGF获得高效表达和展示。

猪表皮生长因子间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原,两者与一定量的抗pEGF多抗反应。结果表明,理想的包被抗原浓度为0.625μg/mL,抗pEGF工作浓度为1∶64000,酶标二抗工作浓度为1∶20000,可检测的最适范围为0.4ng/mL^32ng/mL,最低检测限为1ng/mL,批内和批间变异系数分别为3.50%和5.22%。得到回归方程y=-34.53x+76.06(R2=0.993)和标准曲线,从而建立了快速定量测定pEGF含量的酶联免疫吸附试验方法。

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达

根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据.

猪表皮生长因子在植物乳杆菌中的表达及其活性检测

为获得一株高效表达猪表皮生长因子(p EGF)的重组植物乳杆菌,并检测其生物活性,从仔猪肠道内容物中分离植物乳杆菌,选择其中生物活性最强的一株(Lp-1)为宿主。以商品化乳杆菌表达载体p IAβ8为骨架,干酪乳杆菌超强组成型启动子SCP、M6前体蛋白信号肽SP、猪表皮生长因子p EGF等为元件,构建表达p EGF的植物乳杆菌重组表达载体p SCPSE。用电转化方法 (2.0 k V,2 000?,25μF,4.0 ms)将重组载体p SCPSE转化入宿主菌Lp-1中获得重组植物乳杆菌Lp-p SCPSE。以Tricine-SDS-PAGE法和p EGF ELISA特异性检测试剂盒检测目的蛋白的表达;用培养12 h的阳性转化子菌体给刚断奶的BALB/c小鼠灌胃,2次/d,连续10 d,以断奶小鼠的体重、肠绒毛长度和隐窝深度的变化为指标,检测目的蛋白的生物活性。Tricine-SDS-PAGE检测和小鼠实验结果显示,重组植物乳杆菌的培养上清中出现6 k Da左右p EGF的特异性条带,且表达p EGF的重组植物乳杆菌能显著增加(P<0.05)断奶小鼠的体重、肠绒毛高度和肠隐窝深度。结果表明,p EGF在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物学活性。