pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA-GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG-FP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP-C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.

pET3c衍生载体的构建及应用研究

对原核表达载体 pET3c进行改建 ,消去载体上非必需的EcoRⅠ、HindⅢ限制酶位点 ,然后在克隆位点BamHⅠ处引入LacZ片段 ,经此二步改建后的载体命名为 pJN982。该载体保留了 pET3c高效表达外源基因的能力 ,同时 ,其融合克隆位点由 1个增至 7个 ,并获得以目视法筛选重组子的能力。应用该载体在E coliBL2 1(DE3)pLysS中融合表达牛碱性成纤维细胞生长因子 ,表达量占菌体总蛋白 30 0 4%。破碎菌体上清经阳离子交换和肝素亲和两步层析 ,得纯度为 95 %的重组蛋白 ,活性检测显示 ,重组蛋白具有与参照品一致的促有丝分裂活性。

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒 (HCV)C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成 3对寡核苷酸引物 ,用PCR法从HCV重组质粒 pHCVc、pBE2和 pGMXNS3 5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段 ( 5 0 1、6 0 3和 90 0bp) ,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和 XhoⅠ 酶切后 ,逐个定向连接到质粒 pcDNA3中 ,转化宿主菌XL1 Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒 pcDNA3 C E2 NS3。

短发卡状PTI-1(PC-3)基因特异性RNA干扰表达载体对PC-3细胞的体外效应

目的:通过基因克隆技术构建人前列腺癌PC3细胞系PTI1(PC3)基因[prostatecarcinomatumor inducinggene1(PC3)]的特异性短发卡shRNA(short hairpinRNA)真核表达载体,采用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术,体外观察对PC3细胞系PTI1(PC3)基因的沉默作用以及干扰后对PC3细胞的体外效应.方法:采用基因克隆技术,将合成的短发卡样特异性PTI1(PC3)RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pEGFP/U6,构建PTI1(PC3)shRNA的真核表达载体,体外转染人前列腺癌PC3细胞,48h后观察细胞生物学变化;提取转染细胞总RNA及总蛋白,行RT PCR以及West ernblot观测胞内PTI1(PC3)mRNA及蛋白水平.结果:①成功构建短发卡样PTI1(PC3)shRNA真核表达载体pEGFP/U6mPs;②转染(脂质体法)PC3细胞,48h后细胞大部分死亡;③转染48h后细胞内PTI1(PC3)mRNA水平下降;④转染48h后下调胞内PTI1(PC3)蛋白水平.结论:本实验成功构建的shRNA真核表达载体通过RNA干扰,能够干扰人前列腺癌PC3细胞内PTI1(PC3)基因的表达,抑制PTI1(PC3)蛋白的表达,降低了由PTI1蛋白可能发挥的“翻译失真性”作用,促进癌细胞的死亡,进一步揭示了PTI1在前列腺癌发生、发展过程中的显性癌基因作用.由于RNA干扰的特异性从而为临床上前列腺癌的基因治疗提供了新的可能的方法.

碳载体的O_3处理对直接甲醇燃料电池Pt-Ru/C催化剂性能的影响

为了提高直接甲醇燃料电池阳极催化剂的催化活性,利用O_3处理的Vulcan XC-72碳黑为载体,制备Pt-Ru/C催化剂,并与未经处理的Vulcan XC-72为载体制备的Pt-Ru/C催化剂的性能进行比较.采用XPS和BET测试了O_3处理后碳粉表面的含氧浓度和比表面积,结果表明,随处理时间延长,碳表面含氧浓度先减少后增加,比表面积减小;而随着处理温度升高,比表面积增加,含氧浓度先减少后增加.XRD,TEM方法对催化剂的结构及形貌的表征结果表明:O_3处理的碳黑为载体制备的Pt-Ru/C催化剂粒径均匀、分散性好.在0.5mol/L CH3OH和0.5mol/L H2SO4溶液中,利用粉末微电极测试了循环伏安和稳态极化曲线,结果表明:O_3处理碳粉为载体的催化剂比未经处理的碳粉为载体的催化剂的活性高.研究了O_3处理碳粉的时间和温度对催化剂性能的影响,电化学测试表明:140℃处理6min的碳粉为载体制备的催化剂对甲醇的电催化氧化活性最佳.

C-末端缺陷JAK3逆转录病毒载体的构建及在真核细胞中的表达

目的 以逆转录病毒 PL XSN为载体 ,构建重组逆转录病毒 C-末端缺陷的 JAK3[c- term defi-cient JAK3,JAK3(ΔC) ]载体 PL JAK3(Δ C) ,以 BAL B/ c3T3为靶细胞 ,转染 JAK3(ΔC) c DNA,检测 JAK3(Δ C)蛋白在真核细胞中的表达情况。为利用 JAK3(ΔC)对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 用限制性内切酶法从质粒 Pc DNA3- JAK3(Δ C)中分离目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体 PL XSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体 PL JAK3(Δ C) ,通过转化感受态细菌扩增并检测 DNA序列及限制性内切酶酶切鉴定 ;用脂质体L IPOFECTAMINE介导法将 PL JAK3(Δ C)转染包装细胞 PA317细胞 ,并用 G4 18筛选抗性细胞克隆 ,收集病毒 ;用该病毒感染靶细胞 BAL B/ c3T3,G4 18筛选抗性克隆并测定病毒滴度 ;抗性细胞扩增培养 ,细胞溶解后经免疫沉淀 (IP)、Western blotting检测 BAL B/ c3T3细胞中 JAK3(Δ C)的表达情况。结果 1重组逆转录病毒载体 PL -JAK3(Δ C)酶切和 DNA测序均表明含有 2 796 bp的 JAK3(ΔC)基因 ;2病毒滴度为 1.2× 10 4 CFU/ ml;3PL JAK3(Δ C)转染 BAL B/ C3T3细胞中表达出了 JAK3(Δ C)蛋白 ,其相对分子质量为 10 7× 10 3。结论 该研究构建的 C-末端缺陷 JAK3重组逆转录病毒载体 PL JAK3(

EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因。将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功。用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达。以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/0.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用。结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础。

大豆fad3c基因沉默载体的构建

构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。

多孔陶瓷为载体的C_3馏分选择加氢催化剂的研究

采用氧化铝涂层改性后的多孔陶瓷为载体,制备以钯为活性组分的C3馏分选择性加氢催化剂。该载体可提供较大的比表面积,催化剂活性组分负载均匀。微反实验结果表明,制备的催化剂具有较高的C3馏分选择加氢活性和选择性。

Reg3β干扰载体的构建及在H9C2心肌细胞中的鉴定

目的构建再生基因蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3 beta,Reg3β)干扰载体,并在H9C2大鼠心肌细胞中优化转染条件,鉴定抑制效果,为深入探索Reg3β在心血管疾病的作用提供有利的工具。方法设计合成Reg3β干扰序列,在5'端加入一个Sac 1的酶切位点,3'端加人L0OP环序列和反向互补序列,构建pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体。接着分别用Li-pofectamine2000和Lipofectamine3000优化摸索转染大鼠H9C2心肌细胞的效率,以q-PCR和Western blot法检测H9C2细胞内Reg3β的表达量。结果设计合成了3对Reg3β干扰序列,从中筛选出抑制效率最高达67.93%的序列.酶切和测序结果证实成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA。经过优化比较发现,pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体Lipofeetamine3000比例为1μg:3μl时,其转染效率最高(50%以上)。q-PCR和Western blot法检测结果显示,最佳干扰载体在最高转染条件下可使H9C2细胞Reg3β表达量降低50%以上。结论成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体,并在H9C2细胞中有效干扰Reg3β的表达,可用于探讨Reg3β在心血管疾病中的作用。

外磁场下磁性纳米C3转移酶载体在大鼠损伤脊髓中的分布

目的:观察施加外磁场后磁性纳米C3转移酶药物载体(简称载药微球)在大鼠损伤脊髓局部的分布情况,并观察不同时间作用的外磁场对该载体分布的影响。方法:构建载药微球,检测其粒径、Zeta电位,透射电镜观察形态、测定磁场顺应性及药物释放;MTT法测定其细胞毒性;观察体外培养条件下细胞的摄取情况。82只大鼠建立T10损伤模型(NYU法),随机分为5组:A组,经尾静脉注射异硫氰酸荧光素组,20只;B组,经尾静脉注射载药微球组,20只;C组,经尾静脉注射载药微球+外磁场15min组,20只;D组,经尾静脉注射载药微球+外磁场30min组,12只;E组,经尾静脉注射载药微球+外磁场1h组,10只。A、B、C组各取10只大鼠,经尾静脉注射1h后,取肝、肾、脾及T10为中心的脊髓组织做冰冻切片并观察载药微球在其中的分布;5组各10只大鼠经尾静脉注射1h后取T10为中心4cm脊髓组织,火焰原子吸收分光光度法测定铁含量;D组取2只大鼠,电镜观察载药微球在脊髓组织中分布。结果:载药微球分散性好,载药微球磁化强度饱和度值为63.5emu/g,载药微球缓慢释放药物且释药时间超过9d,载药微球与细胞共培养,细胞平均存活率为78.10%,与细胞共培养5s后能够在细胞内达到良好聚集效果。C组脊髓损伤中心荧光强度高于A、B组。C组脊髓铁元素含量高于A、B组,D组测定铁含量高于C组(P<0.05),E组测定铁含量高于C组(P<0.05),D组测定铁含量与E组无统计学意义(P>0.05)。电镜观察载药微球聚集在损伤中心,可进入神经细胞胞体内。结论:磁性纳米C3转移酶药物载体可靶向聚集在损伤区局部,载药微球可进入脊髓损伤区神经细胞内;损伤后施加外磁场30min,载药微球可达到最佳聚集效果。

金黄色葡萄球菌肠毒素C3过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3（SEC3）过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增SEC3基因片段;用Age I酶切线性化GV365慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA法测定慢病毒载体滴度。结果：获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3慢病毒载体,通过PCR及DNA测序鉴定,证明GV365-SEC3质粒构建正确;转染293T细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 k D大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA检测病毒载体滴度为5×10~8TU/ml。结论：成功构建GV365-SEC3过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。

兔病毒性出血症3C基因荧光表达载体的构建及其在293 T细胞中的表达

目的：构建EGFP与3C融合表达的真核表达质粒，为研究RHDV 3C蛋白在病毒感染中的作用提供基础。方法 RHDV 3C基因的片段经过反转录成cDNA，纯化的PCR产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到pEG-FP－C1载体，构建EGFP与3C融合表达的真核表达质粒。 pEGFP－C1－3C真核表达载体转染293T细胞，24 h后荧光显微镜检测及Western blot检测EGFP－3C融合蛋白表达情况。结果24 h后荧光显微镜及Western blot检测表明RHDV 3 C基因全长编码序能够成功插入到pEGFP－C1载体。结论 EGFP－3 C融合表达质粒能够被成功构建，从而有助于探索RHDV 3C蛋白在RHDV感染过程中的功能，为深入探讨RHDV的防治提供基础。

表达A3C的HBV载体质粒抑制HBV的研究

目的观察表达人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)的复制缺损型HBV载体质粒抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法利用PCR技术和基因重组方法构建表达A3C和人绿色荧光蛋白(hrGFP)的HBV载体质粒pCH-LJ3-A3C、pCH-LJ3-hrGFP,分别与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot检测;提取细胞裂解液中核心蛋白相关的HBV DNA,PCR扩增,克隆,测序。结果pCH-LJ3-A3C对细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA具有抑制作用,使细胞浆内HBV DNA减少31%,使上清液中子代病毒颗粒HBV DNA减少40%;对HBV DNA具有编辑作用,50个克隆测定HBV DNA序列,36克隆出现G-A突变,G-A突变总数量982位点。结论pCH-LJ3-A3C可以抑制HBV复制,pCH-LJ3-A3C对HBV DNA的编辑作用是其发挥作用的主要原因,pCH-LJ3-A3C可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗HBV感染。

C3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建

为克隆C_3基因启动子序列,构建C_3基因启动子荧光素酶报告基因载体,运用PCR的方法从血液中提取到的基因组DNA中获得目的基因,双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建C_3基因启动子报告基因载体.构建的pGL3-Basic-C_3-promotor重组质粒和内参质粒SV40瞬时转染Hela细胞,检测荧光素酶活性.结果表明,PCR扩增出C_3基因启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染Hela细胞后经双荧光素酶报告基因检测确定重组体有启动子活性.成功构建了C_3启动子报告基因载体,在细胞系中进行初步活性分析得知所克隆的C_3基因调控序列包含启动子活性区域.

含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用(英文)

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEF),通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。

五种重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达

目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础。方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平。结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达。