牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。

pEGFP-N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的:构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法:利用RT-PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT-PCR检测Snail在该细胞中表达。结果:本实验成功构建了pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。

伴N-RAS及CBL突变的幼年型粒单核细胞白血病快速急变后单倍体移植1例报告并文献复习

目的减少对幼年型粒单核细胞白血病(JMML)的误诊,探讨单倍体造血干细胞移植治疗急变后未获得完全缓解JMML的可行性,并分析JMML快速急变的原因。方法 3岁患儿历经误诊为免疫性血小板减少症(ITP)和传染性单核细胞增多症后确诊为JMML,伴有N-RAS及CBL基因突变,但快速急变为急性髓细胞性白血病AML-M4型,伴有EVI1阳性表达。患儿接受母亲单倍体(HLA 7/10相合)造血干细胞移植,预处理方案为阿糖胞苷+白舒非+猪抗人T细胞免疫球蛋白+环磷酰胺,移植后采用环孢素A+霉酚酸酯(MMF)+短程甲氨蝶呤+甲基强的松龙方案预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果移植后+14d白细胞植活,+18d血小板植活,未发生重度GVHD。移植后2个月减停全部免疫抑制剂,随访至2018年8月1日,患儿无病存活。结论 JMML急变后未获得完全缓解行单倍体造血干细胞移植治疗是可行的,同时存在N-RAS及CBL基因突变且有EVI1阳性可能是患儿快速急变的原因。

重组质粒pEGFP-N1-Srv+免疫SD大鼠后对龋齿的影响

目的:将已构建的变形链球菌表面蛋白可变区重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫SD大鼠,观察其在大鼠体内的原位表达,免疫定菌鼠后的特异性抗体形成及对龋齿的影响。方法:20只SD大鼠随机分为4组,重组质粒pEGFP-N1-Srv+经股四头肌肌肉注射和下颌下腺区皮下注射2种途径免疫大鼠,免疫组化观察重组质粒的原位表达;24只SD大鼠随机分为4组,免疫途径同上,免疫剂量为100μg/只,2周后加强免疫1次。应用间接酶联免疫吸附法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体,Keyes龋齿计分法评估磨牙的患龋情况。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①大鼠股四头肌细胞、下颌下腺组织内均见重组质粒的阳性表达。②重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫定菌SD大鼠后,可检测到血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体水平升高,均于首次免疫后第4周达到高峰;该时段各组间的抗体水平,实验组均显著高于对照组(P<0.01);经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射组(P<0.05)。③重组质粒免疫定菌鼠后,实验组和对照组间的龋齿计分无显著差异(P>0.05)。结论:重组质粒pEGFP-N1-Srv+能够在动物体内原位表达,并能诱导SD大鼠血清特异性IgG和唾液特异性sIgA抗体增高;经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射,具有一定的免疫优势。但该区域单独的龋齿预防效果不明显。

结直肠腺癌中K-ras/N-ras基因突变状态及Fascin-1蛋白表达的相关性研究

目的:探讨Ras基因突变和Fascin-1蛋白表达在结直肠癌侵袭转移过程中的相关性。方法:选取2017年1月至2019年12月80例散发性结直肠腺癌石蜡组织标本,应用等位基因特异性PCR法(ARMS法)及免疫组化技术检测K-ras基因、N-ras突变和Fascin-1蛋白的表达情况,分析两者与结直肠癌临床病理参数的关系,并对K-ras基因、N-ras基因突变和Fascin-1蛋白表达进行相关性分析。结果:80例结直肠癌样本K-ras基因突变24例,突变率为30%(24/80);N-ras基因突变4例,突变率为5%(4/80),N-ras基因突变与年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期无关(P>0.05);Fascin-1蛋白高表达率为23.8%(19/80),Fascin-1蛋白高表达与淋巴结转移(P=0.034)及TNM分期相关(P=0.046);Fascin-1蛋白高表达率与K-ras基因及N-ras基因突变率均存在相关性(r=0.276,r=0.411,P<0.05)。结论:结直肠腺癌中Fascin-1蛋白高表达的患者更易发生淋巴结转移和远处转移,且K-ras/N-ras基因突变的结直肠腺癌患者更易出现Fascin-1蛋白的高表达,Ras基因可能参与了Fascin-1蛋白表达的调控。

HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究

目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。

稳定表达Makorin环指蛋白1基因对人宫颈癌Siha细胞的影响

目的研究稳定表达Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因对人宫颈癌细胞系Siha细胞的影响。方法利用作者构建的稳定表达MKRN1基因的Siha细胞株,观察MKRN1基因对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录表达水平、端粒酶活性以及其对细胞周期的影响。结果转染Siha细胞后,稳定表达MKRN1基因明显抑制细胞hTERT基因mRNA水平的表达,明显抑制细胞中端粒酶活性,并且G1期细胞明显增加,而S期细胞明显减少。结论稳定表达MKRN1基因可特异性降低宫颈癌细胞中hTERT mRNA水平,抑制癌细胞内端粒酶活性,抑制宫颈癌细胞增殖,并且阻止宫颈癌细胞从G1期进入S期,促进细胞凋亡。

TMAO与RAS在心血管疾病中的相互作用研究进展

心血管疾病是我国亟待防治和解决的重大公共卫生问题,明确心血管疾病诊治过程中的关键标志物及治疗靶点对于临床工作意义重大。氧化三甲胺(TMAO)是一种肠道细菌的代谢产物,其与心血管疾病的发生和发展密切相关。肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体内最重要的体液稳态调节系统,在心血管疾病的过程中同样扮演重要角色。近来一些研究将氧化三甲胺和肾素-血管紧张素系统联系起来,研究两者之间存在的相互作用,探究两者参与心血管疾病的病理过程。在本篇综述中,主要概述氧化三甲胺和肾素-血管紧张素系统之间的相互作用在心血管疾病中的研究进展。

T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期调节的研究

目的探讨T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期的影响。方法应用脂质体LipofectamineTM2000将构建的pEGFP-N1-T-钙黏蛋白以及pEGFP-N1空载体转染至B16F10细胞,OPTI-MEM培养基体外培养6 h后RPMI-1640继续培养24 h,应用碘化丙啶标记,流式细胞仪检测T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期的影响。结果转染T-钙黏蛋白组G0/G1期和G2/M期细胞比率分别为(60.917±1.897)%、(8.513±0.651)%,明显高于未转染组的(53.563±1.856)%、(2.627±0.434)%和pEGFP-N1空载体组的(53.880±2.164)%、(2.770±0.466)%,差异有显著性(P<0.05);转染T-钙黏蛋白组S期细胞比率为(30.570±1.368)%,低于未转染组的(43.810±2.003)%及pEGFP-N1空载体组的(43.350±2.629)%,差异有统计学意义(P<0.05)。未转染组与转染pEGFP-N1空载体组各期差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 T-钙黏蛋白使B16F10细胞G0/G1期和G2/M期比率增高,S期比率降低。

pEGFP-N1-hIL-1Ra真核表达质粒的构建及其在兔软骨细胞中的稳定表达

目的构建含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP—N1-hIL-1Ra，稳定转染兔软骨细胞后检测其表达。方法通过RT—PCR扩增hIL-1Ra基因，并在两端添加HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。将pEGFP—N1载体经BamHⅠ酶切后电泳鉴定，利用定向克隆技术将经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后的hIL-1Ra基因片段和pEGFP-N1载体经T4连接酶进行连接。重组的pEGFP—N1-hIL-1Ra在大肠杆菌DH5α感受态细胞内扩增，经过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建是否成功。将构建正确的pEGFP—N1／hIL-1Ra重组质粒DNA由脂质体介导转染兔软骨细胞，RT—PCR检测基因的表达，western-blot检测蛋白的表达。结果通过对重组质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析，证明真核表达质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra构建成功，开放阅读框架正确。稳定转染兔软骨细胞后，RT-PCR得到目的基因片段，ELISA检测到目的蛋白的表达。结论利用DNA重组技术能成功将hIL-1Ra基因克隆入pEGFP—N1载体中，构建出真核表达质粒pEGFP-N1-hIL-1Ra，并获得了稳定表达目的IL-1Ra的兔软骨细胞系，为骨关节炎的基因治疗研究奠定了实验基础。

一种在含水溶剂中从1,1-二溴乙烯合成末端炔的新方法

报道了1种从1,1-二溴乙烯制备端炔的方法,使用便宜易得的四丁基溴化铵(TBAB)、碳酸钾和三苯基膦为试剂,在含水二甲基甲酰胺(DMF)中进行反应。该反应条件温和、底物适应范围广、收率高,是传统Corey-Fuchs反应的重要改进。

广西肝癌中HBV感染与N-ras基因突变的研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和免疫组化法检测２９例广西南部肝癌（ＨＣＣ）组织中的Ｎ－ｒａｓ基因突变和ＨＢＶ感染状况。结果，肝癌中Ｎ－ｒａｓ基因在第２～３７密码子之间的突变率为７９．３％，其中２２例（７５．８６％）有２～５个突变位点。该基因突变也见于癌旁组织（８０．７７％）。肝组织中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｘＡｇ检出率分别为８６．２％和７９．３％，两者具有相关性，并与Ｎ－ｒａｓ基因突变率呈相平行的趋势。因广西南部的肝癌与ＡＦＢ１污染有关。

重组人白介素1受体拮抗剂对肝细胞的保护作用

目的·利用HepG2细胞建立D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal N)体外肝细胞损伤模型,研究重组人白介素1受体拮抗剂(recombinant human IL-1Ra,rh IL-1Ra)对肝细胞的保护作用。方法·建立D-Gal N诱导HepG2细胞损伤模型,将HepG2细胞放置于含有不同浓度的D-Gal N培养基中(0.02、0.2、2、4 mg/m L),在第1、2和3日分别观察细胞形态和活力变化,优化D-Gal N浓度和处理时间;研究不同IL-1Ra浓度(10、20、50μg/m L)处理的D-Gal N损伤模型细胞形态变化,测定细胞活力;分析各组细胞凋亡情况和各组胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平,运用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测各组细胞中凋亡诱导相关细胞因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 (interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的m RNA水平,并采用ERK1/2通路抑制剂(SCH772984)检测IL-1Ra是否是通过促进肝损伤细胞ERK1/2磷酸化的方式来保护肝细胞。结果·采用4 mg/m L浓度的D-Gal N处理HepG2细胞2 d后,细胞活力显著下降;rh IL-1Ra显著提高损伤模型细胞的存活率,减少细胞中ROS的生成,显著抑制D-Gal N诱导的细胞内凋亡诱导相关细胞因子的表达;ERK1/2信号途径在介导IL-1Ra保护肝细胞的损伤过程中有一定的作用。结论·rh IL-1Ra可直接靶向肝细胞,并通过在细胞内上调ERK1/2信号通路的活化水平,抑制细胞凋亡,发挥对肝损伤细胞的保护作用。

变形链球菌表面蛋白可变区真核载体质粒pEGFP—N1-SrV＋的构建及在293T细胞的表达

目的构建变形链球菌（变链菌）表面蛋白可变区（extended-v）真核表达质粒pEGFP—N1-SrV＋，并转架哺乳动物细胞293T，为进一步研究该区功能奠定基础。方法根据已报道变链菌OMZl75的srv＋基因序列，化学合成SrV＋的编码基因srv＋，将真核载体质粒pEGFP—N1和srv＋基因片段分别用KpnⅠ／XhoⅠ双酶切，连接获取重组质粒pEGFP-N1-Srv＋，并对其进行PCR、酶切和测序鉴定。通过H旨质体法瞬时转染哺乳动物细胞293T。运用荧光显微镜观察、Westernblot及real-timePCR法橙。目的蛋白在293T细胞中的表达情况。结果通过基因化学合成技术，获得1136bp的目的基因srv＋，经测序鉴定与模板目的基因序列一致；成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV＋；PCR扩增检测可获得1．33kb目的基因片段；KpnI／XhoI双酶切可见4．7kb和1．1kb两条电泳条带，证实重组质粒pEGFP-N1-SrV＋携带目的基因；通过荧光显微镜观察到重组质粒pEGFP．N1-SrV＋融合GFP后的表达，目的细胞的转染效率达到80％以上；Westernblot检测到相对分子质量（Mr）为72×10^3处有特征条带，其大小和Srv＋融合蛋白（42×10^3＋28×10^3=70×10^3）相吻合；real-timePCR数值分析显示：在293T细胞中，s邢＋基因的过表达效果显著。结论成功构建了真核表达载体质粒pEGFP-N1-SrV＋，并能够在哺乳动物细胞293T中表达。

pEGFP—N1-hPer2载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的构建人的生物钟基因Period2（hPer2）真核表达载体pEGFP-N1-hPer2，观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达。方法应用实时定量荧光反转录聚合酶链反应（FQ—PCR）技术从MG63细胞中扩增hPer2，并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP—N1的多克隆位点，采用脂质体介导转染骨肉瘤细胞MC63，采用FQ-PCR和Westernblot分别检测hPer2的表达。结果重组质粒经PstI、KpnI双酶切和测序与hPer2基因序列一致，利用脂质体介导将pEGFP—N1-hPer2重组质粒成功转染到骨肉瘤细胞MG63中并获得了hPer2基因的过表达。FQ-PCR显示实验组（pEGFP—N1-hPer2组）的mRNA水平（7．84±1．17）明显高于空载体组（pEGFP—N1组，1．42±2．11）和空白对照组（1．21±1．61）；Westemblot显示实验组hPer2蛋白（0．382±1．131）的表达明显高于空载体组（0．178±2．110）和空白对照组（0．166±1．951），差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建pEGFP—N1-hPer2真核表达载体，并能够在骨肉瘤细胞MG63中过表达。

建立pEGFP—N1-TGF-β1重组质粒和脂质体介导转染原代培养新生猪AEC-Ⅱ方法

目的构建pEGFP—N1—TGF-β1重组质粒，利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）中，为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础。方法应用含人TGF—β1CDS的质粒，设计PCR引物扩增出其CDS片段，将其与空质粒pEGFP—N1用Xhol和EcoRI双酶切，T4DNA Ligase连接双酶切产物，将连接产物转化入DH5α中，培养16h后抽提质粒，PCR法鉴定和测序证实TGF—β1 CDS序列正确。采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染，将新生猪AEC—Ⅱ原代培养48h至细胞融合80％-90％，换为无血清培养液；将质粒DNA（pEGFP—N1-TGF—β1重组质粒）和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀，置于培养箱中培养4—6h，更换为完全培养液；转染24—48h后，荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平。结果PCR法及测序鉴定证实TGF—β1 CDS序列正确，重组质粒构建成功，采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195．5μg/mL，转染后48h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达，证实已将其成功转染入原代培养的AEC—Ⅱ中。结论成功构建了pEGFP-N1—TGF-β1真核表达载体，并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC—Ⅱ中，为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础。

虹鳟Ⅰ型干扰素e7在胖头鳜肌肉细胞中的表达及其抗传染性造血器官坏死病毒活性检测

为表达虹鳟Ⅰ型干扰素e7(IFNe7),并检测其抗传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的活性,本实验采用RT-PCR从虹鳟肾脏组织中扩增虹鳟IFNe7基因,克隆至p MD19-T载体,测序分析后构建重组真核表达载体p EGFP-IFNe7,并转染至胖头鳜肌肉细胞(FHM)检测其抗病毒活性。结果显示,虹鳟IFNe7基因序列为561 bp,编码186个氨基酸,与大西洋鲑Ⅰ型干扰素(IFN-I)亲缘关系最近。通过荧光观察、RT-PCR及western blot方法鉴定显示,真核表达载体p EGFP-IFNe7能在FHM细胞中表达49 ku的重组蛋白;采用细胞病变抑制法表明IFNe7具有抗IHNV的活性。本研究为进一步研究虹鳟病毒性疾病奠定基础。

两种新型2-偕二硝甲基-5-硝基四唑含能离子盐的合成、表征及性能预估

以氨基-1,2,4-三唑和2-偕二硝甲基-5-硝基四唑(HDNMNT)为原料,通过中和反应合成出两种新型含能离子盐——2-偕二硝甲基-5-硝基四唑3-氨基-1,2,4-三唑盐(3-ATDNMNT)和2-偕二硝甲基-5-硝基四唑4-氨基-1,2,4-三唑盐(4-ATDNMNT),收率分别为95.4%和96.7%;利用FT-IR、1 H NMR、13C NMR、15 N NMR及元素分析等方法对其结构进行表征;采用量子化学方法计算了3-ATDNMNT和4-ATDNMNT的爆轰性能;在标准状态下(膨胀比为70∶1),利用最小自由能原理,分别计算了两种离子盐在丁羟复合推进剂中的能量性能。结果表明,3-ATDNMNT的爆速和爆压分别为8.587km/s和33.58GPa,4-ATDNMNT的爆速和爆压分别为8.693km/s和34.31GPa。以3-ATDNMNT部分取代丁羟复合推进剂中的AP后,丁羟复合推进剂的理论比冲可达2 635.7N·s/kg。以4-ATDNMNT部分取代丁羟复合推进剂中的AP后,当HTPB、Al、AP及4-ATDNMNT各组分质量分数分别为10%、5%、15%及70%时,获得该丁羟复合推进剂的最高理论比冲为2 677.2N·s/kg。