pEGFP-N1质粒转染乳鼠心肌细胞的分布及效率

目的 :研究 pEGFP N1质粒转染心肌细胞的分布及效率。 方法 :培养乳鼠心肌细胞 ,根据乳鼠心肌细胞的不同生长时间 (1～ 3d)进行 pEGFP N1质粒转染心肌细胞的实验研究。 结果 :乳鼠心肌细胞生长 1d时 ,pEGFP N1质粒转染心肌细胞的效率显著高于乳鼠心肌细胞生长 2d、3d时 ;pEGFP N1质粒转染心肌细胞后EGFP均匀地充满胞浆和胞核。结论 :pEGFP N1质粒转染乳鼠心肌细胞的效率与心肌细胞的生长期有关 ;EGFP在心肌细胞中均匀分布于胞浆和胞核。

pEGFP-N1脂质体转染方法的优化及其应用

目的:应用脂质体介导的转染方法将pEGFP-N1转染入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中,并获得较佳的优化方案,阐明该优化条件在转染其他目的基因时的适用性。方法:分别选取不同配比的质粒和脂质体,将pEGFP-N1转入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞。转染后36h,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率;台盼蓝染色法检测细胞存活率,以此获得优化的转染条件。同时将pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5分别以上述条件转染,并获取相应优化的转染条件。结果:在质粒质量固定的条件下,随着脂质体质量的增加,其转染效率和细胞存活率升高;但是当质粒∶脂质体>1∶4时,转染效率和细胞存活率下降。在质粒和脂质体比例固定而质量增加时,其转染效率和细胞存活率下降;当质粒∶脂质体>3.2μg∶12.8μL时,转染效率降低。应用脂质体介导的方法转染pEGFP-N1和转染pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5时,在质粒与脂质体的配比为1∶4(3.2μg∶12.8μL)时,转染效率达最高。结论:在应用脂质体介导的目的基因转染时,pEGFP-N1优化的转染条件具有较为广泛的适用性,可用作后续目的基因高效转染优化条件。

重组质粒pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的评估重组质粒pEGFP-N1-Twist对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用real-time PCR和Western blot检测Twist基因与蛋白的表达情况;通过Transwell及MTT试验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果转染了pEGFP-N1-Twist的SKOV3细胞中Twist基因/蛋白的表达明显上调;转染组较空白对照组侵袭及迁移能力增强(P<0.05),细胞增殖能力明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的侵袭及迁移能力、细胞增殖能力。

真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.

pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取VEGF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/VEGF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒。结论为进一步研究利用VEGF基因修饰骨组织工程骨,促进血管再生提供实验基础。

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。

pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取骨形态发生蛋白(BMP-2)的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/BMP-2重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果通过测序、酶切鉴定,证明pMD18-T/BMP-2质粒构建成功。结论本实验成功构建了pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,为进一步研究利用BMP-2基因修饰骨组织工程骨种子细胞提供实验基础。

真核表达载体pEGFP-N1-hSyntenin的构建及其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达

目的构建pEGFP-N1-hSyntenin基因真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞CHG-5中的表达。方法采用RT-PCR技术从人脑肿瘤组织中扩增hSyntenin,并将PCR产物双酶切后定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒。经过菌落PCR、双酶切及测序验证后,采用脂质体转染技术将pEGFP-N1-hSyntenin融合基因转染CHG-5细胞表达,G418筛选建立稳定表达hSyntenin的CHG-hS细胞系。采用荧光检测和免疫印迹技术分析hSyntenin在稳定转染的CHG-5细胞系中的表达。结果菌落PCR鉴定出1个阳性克隆,阳性克隆经双酶切鉴定得到分别与载体和目的片段大小一致的4.7kb和897bp的两条片段,测序证实目的基因hSyntenin正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点;pEGFP-N1-hSyntenin重组体稳定转染CHG-5细胞后,细胞荧光检测结果显示hSyntenin在CHG-5细胞质发出绿色荧光,免疫印迹检测可见32×103处的阳性条带。结论成功构建pEGFP-N1-hSyntenin重组质粒,并在人脑胶质瘤细胞CHG-5中获得稳定表达。

人血管性血友病因子裂解蛋白酶pEGFP-N1真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

本研究旨在构建人血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)的pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13在细胞内合成及其分泌提供有力工具。通过PCR方法获取目的基因片段,并在目的基因两端加上限制性酶切位点。限制性内切酶酶切后,连接至pEGPF-N1真核表达载体。连接后获得质粒进行酶切鉴定及DNA测序验证,并转染HeLa细胞。通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,Western blot方法鉴定所得蛋白。结果表明,酶切鉴定及DNA测序确认目的基因与载体正确连接,在荧光显微镜下观察到绿色荧光。Western blot显示,转染后HeLa细胞表达ADAMTS13蛋白。结论:成功构建了ADAMTS13-pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13合成、分泌及其代谢的生理学机制提供了研究工具。

Caveolin-1基因PEGFP-N1真核表达载体的构建及表达

目的:克隆caveolin-1(CAV1)基因开放阅读框的cDNA序列,构建PEGFP-N1/CAV1的真核表达载体。方法:设计并合成带酶切位点及保护碱基的引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,PEGFP-N1载体及caveolin-1基因片段进行限制性双酶切,电泳后回收切开的PEGFP-N1及caveolin-1片段,经连接反应后构建PEGFP-N1/CAV1真核表达载体。结果:PEGFP-N1/CAV1重组质粒经PCR电泳结果显示,得到一条在555bp的片段;重组质粒经限制性内酶切双酶切电泳结果证实,可释放一条在555bp的片段和4.8kbp的载体片段;重组质粒测序结果,经BLAST比对,100%符合;瞬时转染宫颈癌Hela细胞48h荧光显微镜及实时荧光定量PCR证实重组质粒在宫颈癌Hela中得到表达。结论:成功构建了同时携带有绿色荧光蛋白及G418筛选位点的PEGFP-N1/CAV1真核表达载体复合体。

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的构建PGC—1α真核表达载体pEGFP—N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达。方法通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP—N1中,构建pEGFP—N1-PGC-1α重组质粒。结果双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒。结论成功构建了pEGFP—N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础。

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoli.DH5(大肠杆菌),大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine TM2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Western blotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-synuclein。

pEGFP-N1-IL-17通过调控Fas/FasL信号通路影响喉癌Hep-2细胞的凋亡

目的:研究重组质粒白介素17(pEGFP-N1-IL-17)对喉癌细胞(Hep-2细胞)凋亡的影响,阐述pEGFP-N1-IL-17通过Fas/FasL信号通路抑制Hep-2细胞凋亡的机制。方法:设置未转染的Hep-2细胞为空白对照组,pEGFP-N1-NC转染的喉癌Hep-2细胞为阴性对照组,pEGFP-N1-IL-17转染的喉癌Hep-2细胞为实验组。qRT-PCR、Western blot实验用来检测IL-17在Hep-2细胞的表达水平,成功构建了IL-17过表达载体。用Western blot检测空白对照组、阴性对照组、实验组中Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白的表达情况。用流式细胞仪检测空白对照组、阴性对照组、实验组细胞的凋亡率。结果:IL-17过表达载体转染喉癌Hep-2细胞后,qRT-PCR检测IL-17表达水平上调数倍。与阴性对照组相比,空白对照组Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达无明显差异。与阴性对照组相比,实验组喉癌Hep-2细胞内Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。空白对照组、阴性对照组的细胞凋亡率没有明显变化。与空白对照组相比,实验组的喉癌Hep-2细胞的凋亡率有明显降低。结论:IL-17可能通过Fas/FasL信号通路来抑制喉癌Hep-2细胞凋亡。

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。

pEGFP-N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的:构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法:利用RT-PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT-PCR检测Snail在该细胞中表达。结果:本实验成功构建了pEGFP-N1-Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。

重组质粒pEGFP-N1-Srv+免疫SD大鼠后对龋齿的影响

目的:将已构建的变形链球菌表面蛋白可变区重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫SD大鼠,观察其在大鼠体内的原位表达,免疫定菌鼠后的特异性抗体形成及对龋齿的影响。方法:20只SD大鼠随机分为4组,重组质粒pEGFP-N1-Srv+经股四头肌肌肉注射和下颌下腺区皮下注射2种途径免疫大鼠,免疫组化观察重组质粒的原位表达;24只SD大鼠随机分为4组,免疫途径同上,免疫剂量为100μg/只,2周后加强免疫1次。应用间接酶联免疫吸附法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体,Keyes龋齿计分法评估磨牙的患龋情况。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①大鼠股四头肌细胞、下颌下腺组织内均见重组质粒的阳性表达。②重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫定菌SD大鼠后,可检测到血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体水平升高,均于首次免疫后第4周达到高峰;该时段各组间的抗体水平,实验组均显著高于对照组(P<0.01);经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射组(P<0.05)。③重组质粒免疫定菌鼠后,实验组和对照组间的龋齿计分无显著差异(P>0.05)。结论:重组质粒pEGFP-N1-Srv+能够在动物体内原位表达,并能诱导SD大鼠血清特异性IgG和唾液特异性sIgA抗体增高;经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射,具有一定的免疫优势。但该区域单独的龋齿预防效果不明显。

pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。