弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒，为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段，重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，再经含氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段，克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒，亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。

细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用

目的 探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用。 方法 构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR10 2 0 /E ,构建编码小鼠细胞因子 (GM CSF)、白细胞介素 (IL)如IL 4和IL 12的真核表达质粒pcDNA3 /GM CSF、pcDNA3 .1( ) /IL 4和pIL 12以及双顺反子质粒pGM CSF/pTPA E ,分组免疫小鼠 ,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平 ,取小鼠脾细胞进行体外增殖。 结果 3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR10 2 0 /E的免疫应答 ,抗体水平增加 7至 10倍 ,其中pcDNA3 /GM CSF质粒和pIL 12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答 ,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高。 结论 利用编码GM CSF、IL 4和IL 12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1DNA的免疫应答 ,并对免疫应答的类型产生调节作用。

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。

电穿孔法介导质粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′菌株的实验研究

目的探讨电穿孔法介导质粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′的最佳条件,提高其转化效率。方法将pCMV-Scrip质粒转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′菌株,观察不同的电转化条件对转化效率的影响。结果电场强度、脉冲时间、电击缓冲液的离子强度、细菌生长状态、感受态细胞保存时间、质粒DNA浓度对转化效率均有不同程度的影响;在电压2.0kV,电阻200Ω,电容25μF,脉冲时间4.3ms和低离子强度电击缓冲液的条件下转化,能获得较高的转化率。结论优化电穿孔条件能提高转化效率。

弓形体重组质粒pcDNA_3-SAG1免疫小鼠诱导的细胞免疫应答研究

目的 :用 pc DNA3- SAG1真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察 DNA免疫所诱导的小鼠细胞免疫应答 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :大量制备重组质粒 pc DAN3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内 ,每隔 2 1d接种一次 ,一共免疫三次。用 MTT方法对脾脏的 NK细胞和其淋巴细胞的转化率进行测定 ;采用免疫荧光法对 CD4+、CD8+ 细胞进行测定。结果 :实验组 NK细胞杀伤率为 :70 .0± 3.6 4,而 pc DNA3及空白对照分别为 :48.5± 6 .0 8和 47.0± 5 .93。实验组 NK细胞活性比对照组明显增高 (P<0 .0 5 ) ,而 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对 T淋巴细胞亚群 CD4+、CD8+进行动态分析 ,可见随着感染时间的延长 ,CD8+的数量逐渐上升 ,CD4+ / CD8+的比率逐渐下降 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照有明显差异 (P<0 .0 5 ) ;Con A刺激小鼠淋巴细胞转化实验 ,能刺激免疫鼠及对照鼠淋巴细胞增生 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :重组质粒pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的细胞免疫。

TGF-β_1质粒DNA前房注射在角膜内皮细胞表达的实验研究

目的 探索转化生长因子 β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF β1)真核表达质粒pMAMTGF β1前房注射后在角膜内皮细胞的表达及其对局部抗角膜移植排斥反应基因治疗的可能性。方法 利用脂质体介导方法 ,将其直接注射至家兔前房内 ,2d后分别行角膜组织石蜡切片和角膜内皮撕片 ,通过SABC免疫组化方法检测角膜内皮细胞质粒DNA表达产物TGF β1的表达情况。结果 石蜡切片和内皮撕片均可见角膜内皮细胞内质粒DNA表达产物TGF β1的表达为阳性。结论 通过前房注射法 ,外源基因可以转染至角膜内皮 ,并在角膜内皮细胞得到有效表达 ,为进一步研究TGF β1参与角膜局部免疫耐受的诱导和维持奠定了基础。

Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究

目的:构建携带小鼠泛素样同源域和环指结构域1(Uhrf1)基因的重组腺病毒载体,验证Uhrf1基因在原代乳鼠心肌细胞中的表达情况,并探究其在过氧化氢(H_(2)O2)诱导的心肌细胞DNA损伤中的作用。方法:利用PCR扩增小鼠Uhrf1基因的编码序列,将其酶切后插入pADM-CMV-C-FH载体,获得重组腺病毒质粒ADM-Uhrf1。将该质粒转染至HEK293T细胞包装成重组腺病毒颗粒,数代扩增后进行腺病毒的纯化及滴度检测。分离25只1日龄ICR小鼠原代心肌细胞,分为两组,以感染复数(MOI)为50的比例分别感染ADM-Uhrf1及ADM-control(ADMCtrl),通过Western blot及免疫荧光染色验证重组腺病毒介导的UHRF1蛋白的表达,并利用H_(2)O2诱导心肌细胞DNA损伤,进而探究Uhrf1在DNA损伤修复过程中的作用。结果:通过壳蛋白免疫法检测得到的ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×10^(13) pfu/L。Western blot验证显示UHRF1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),免疫荧光染色显示UHRF1主要表达在细胞核内,且Uhrf1的过表达能够显著抑制DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H_(2)A变异体(γH_(2)AX)蛋白的表达(P<0.01)。结论:成功构建了携带小鼠Uhrf1基因的重组过表达腺病毒载体,并通过腺病毒递送系统在心肌细胞中实现了Uhrf1的过表达,且Uhrf1的过表达有效减轻了H_(2)O2诱导的心肌细胞DNA损伤。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒， 直接免疫小鼠， 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒， 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠， 每鼠注射１００ μｇ，２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次， 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性； 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目；ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后， 脾脏明显增大； 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群， ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化， 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果， 与对照组相比较， 无明显增高； 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高， 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠， 可诱导产生细胞及体液免疫应答。

黄瓜线粒体中DNA类质粒的分离与鉴定

应用琼酯糖凝胶电泳、S1酶处理及电镜技术 ,从黄瓜线粒体中分离并鉴定了三种环形 DNA类质粒 ,依其分子由大到小 ,分别称之为 p C1、p C2和 p C3.以类质粒凝胶电泳带的荧光扫描值与 DNA类质粒的分子长度之比作为类质粒拷贝数的参照值 ,对三种类质粒进行荧光扫描分析 ,结果表明 p C3拷贝数明显高于 p C1和 p C2 ;p C2的拷贝数略高于 p

泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达。两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。

S_1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。

真核表达质粒pVAX1的应用

从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来，其在医学领域已取得长足的进步和发展，它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是，目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验，如何使DNA疫苗应用于人体实验，最终走向临床研究，是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。

人胰岛素样生长因子-1甄核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达

目的 :构建人胰岛素样生长因子 - 1(hIGF - 1)真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用DNA重组方法将编码hIGF - 1cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(- )中 ,构建pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1瞬时转染C2C12成肌细胞中 ;采用RT -PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF - 1基因在成肌细胞中的表达情况 ;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF - 1的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1转染成肌细胞后 ,hIGF - 1mRNA及蛋白表达水平明显增高 ;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF - 1蛋白的表达 ,所表达出hIGF - 1蛋白具有生物学活性。

MIP-1α和Flt3l基因佐剂联合应用对HPV16E7 DNA疫苗的免疫增强作用

目的:探讨巨噬细胞炎性蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和酪氨酸激酶受体3配体(Flt3ligand,Flt3l)基因佐剂联合应用增强人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus16,HPV16)E7DNA疫苗免疫效果的可能性。方法:构建真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7。C57BL/6小鼠随机分为8组,分别为pcDNA3组、pcDNA3/MIP-1α组、pcDNA3/Flt3l组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/Flt3l混合组、pcDNA3/HPV16E7组、pcDNA3/MIP-1α和pcDNA3/HPV16E7混合组、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组以及pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组。每组14只,肌肉注射质粒免疫小鼠,每3周免疫1次,共3次;末次免疫后2周每组随机抽取6只小鼠,取脾脏制备淋巴细胞悬液,用CCK-8试剂盒检测其对TC-1靶细胞的特异性杀伤能力。其余小鼠在腹股沟处皮下注射5×104个TC-1细胞,观察肿瘤生长情况。结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7;pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的CTL杀伤能力明显高于其它各组(P<0.01);肿瘤细胞攻击后16天,pcDNA3组小鼠全部长出肿瘤,而pcDNA3/MIP-1α、pcDNA3/Flt3l和pcDNA3/HPV16E7混合组的成瘤率仅为12.5%,明显低于其他组,统计学分析示8组之间成瘤率差异有显著性(P=0.007)。60天后各组成瘤率之间的差异无统计学意义(P=0.229)。结论:联合应用MIP-1α和Flt3l基因佐剂增强了HPV16E7DNA疫苗的免疫效果,一定程度上延缓了肿瘤的发生。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 DNA与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答

目的探索DNA与改良痘苗病毒(MVA)组合免疫对增强恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)抗体应答的作用。方法以人工合成MSP1全基因为基础分别构建DNA免疫质粒VR1020/190和重组MVA,单用VR1020/190或与表达质粒GM-CSF共同对小鼠进行初始免疫后,用重组病毒追加强化,采用DNA/MVA组合方案免疫BALB/c小鼠,ELISA测定血清IgG及其亚类水平,经腹腔接种转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19进行攻击。结果DNA免疫能有效诱导小鼠产生抗MSP1-190抗体,其终点稀释度为1∶2500,GM-CSF质粒共免疫组抗体的终点稀释度为1∶11150,抗体亚类的测定表明GM-CSF质粒显著促进了IgG1类抗体应答,MVA追加可使单独免疫组和共免疫组抗体分别增加53和10倍;两实验组产生了水平相近的抗19000抗体(1∶32000),其含量占血清中MSP1总IgG的1/4-1/3。经转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19攻击后小鼠的存活时间并没有明显延长(P>0.05)。结论采用合成MSP1全基因进行DNA/MVA组合免疫可诱导小鼠产生显著的抗体应答,抗体的详细特性和保护作用正在进一步研究中。

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的 构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因———迟发超敏反应抗原基因 (delayed -typehypersen tivityantigen 1,DHA1)与小鼠共刺激分子B 7-1的嵌合重组质粒。方法 设计合成两对寡核苷酸引物 ,用PCR法分别从pUCmB 7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3 -DHA1中特异扩增出编码B 7-1和DHA1的基因片段 ( 92 1bp和 984bp) ,分别用HindⅢ ,EcoRⅠ ,XbaⅠ酶切后 ,逐个定向连接到质粒pcDNA3中 ,转化宿主菌DH -5α ,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论 该研究成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3 -B 7-1-DHA1。

野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建

目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒。方法采用RT-PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18Tvector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1UCHL1。结果酶切和DNA测序证实,野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中,野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致,C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒。

人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性

目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因—迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersentivity antigen 1,DHA1)与小鼠共刺激分子B7-1的嵌合重组质粒。方法设计合成两对寡核苷酸引物,用PCR法分别从pUCmB7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7-1和DHA1的基因片段(921和984bp),分别用HindⅢ、EcoRⅠ、XbaⅠ酶切后,逐个定向连接到质粒pcDNA3中,转化宿主菌DH-5α,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致,证实符合表达框架。结论本实验成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1,为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。