人β_2-微球蛋白在pET-22b(+)表达载体中的克隆、表达与纯化

目的 :构建人 β2-microglobulin( β2- M)基因的原核表达载体 ,在大肠杆菌中高效表达 β2 -M蛋白质并进行纯化 ,为构建MHC 肽四聚体奠定基础。方法 :从人外周血单核细胞中提取总RNA ,采用RT-PCR技术扩增出去除信号肽部分的 β2-M基因 ,克隆入pET-2 2b( + )表达载体进行诱导表达。采用离子交换层析和凝胶过滤方法对表达产物进行纯化 ,用ELISA和West ernblot法进行免疫学鉴定。结果 :成功地构建了表达载体pET-2 2b( + )- β2-M ,对表达产物进行了纯化 ,并对表达产物进行了鉴定。结论 :获得 β2- M蛋白的高效表达 。

大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因的克隆及其原核表达载体的构建

利用RT-PCR克隆大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增大豆Gly m Bd 30K的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体。结果表明:克隆了大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因,且构建了其原核表达载体。该基因含有长度为1 140 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸。该蛋白质的相对分子质量为42 758,等电点为5.08。序列同源性分析发现其与数据库中已知的Gly m Bd30K基因同源性很高,因此认为其是大豆的过敏原基因,在GenBank数据库中的登录号为EU883600。克隆的大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因及构建的原核表达载体,为大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的重组表达和免疫活性鉴定等奠定基础。

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子,温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体,SDS-PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗,为弓形虫病的防治提供了一种新方法。

RPL30基因哺乳动物表达载体的构建及其初步表达分析

目的克隆RPL30基因并构建其哺乳动物表达载体,然后将该基因导入人肝癌细胞系HepG2进行初步表达分析,并考察RPL30的超表达对硒蛋白P基因转录水平的影响。方法应用RT-PCR方法扩增出目的基因的全长编码区,并利用双酶切连接法将其连入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)。采用脂质体转染法转染HepG2细胞后应用RT-PCR法检测RPL30基因的表达以及其超表达对硒蛋白P基因转录水平的影响。同时在转染细胞中添加无机硒后研究其对RPL30和硒蛋白P基因转录水平的调控。结果成功地构建了RPL30表达质粒pcDNA3.1-RPL30,转染HepG2细胞后实现基因的超表达,相对于GFP对照转染细胞增加了4～5倍。然而,RPL30基因的超表达并没有显著提高硒蛋白P的转录水平。硒对RPL30基因的表达基本上没有影响,但却显著提高硒蛋白P的表达水平。结论 RPL30哺乳动物表达载体的成功构建以及RPL30超表达后的初步分析为下一步深入研究硒蛋白的生物合成机制打下了基础。

miR-30a表达载体构建、病毒包装和表达活性的检测

目的构建携带miR-30a的慢病毒表达载体，为研究miR-30a在慢性粒细胞白血病中的作用机制及对伊马替尼耐药性的影响奠定基础。方法提取人骨髓细胞基因组DNA，扩增miR．30a的前体序列，克隆到plVTHM慢病毒表达载体上，测序鉴定。重组载体进行病毒包装，感染K562细胞，测定病毒滴度。感染的K562细胞用流式细胞仪分选带有绿色荧光的GFP阳性的细胞，对分选的细胞用实时荧光定量PCR法检测miR-30a在细胞内的表达水平。最后用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。结果重组慢病毒表达载体测序完全正确；病毒滴度检测为6×106TU／mL；选用160μL 病毒液／1mL培养基感染K562细胞；感染的K562细胞中miR-30a的表达水平显著增强（P〈0．05）；过表达miR-30a后K562细胞增殖水平显著下降（P〈0．05）。结论成功构建了miR-30a慢病毒表达载体，并可在K562细胞中稳定表达，且miR-30a有抑制K562细胞增殖的作用。

弓形虫P30与佐剂CTA_2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30CTX蛋白奠定基础。方法PCR扩增P30CTX复合基因,产物回收后与pMD18T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T P30CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1313bp的P30CTX基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA P30CTX。重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定。使用生物信息软件分析P30CTX复合基因,预测编码蛋白结构。结果重组质粒经PCR可得1313bp的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1313bp和3085bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP P30CTX基因,序列分析同源性为99.82%,P30CTX蛋白结构折叠无明显改变。结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30CTX的抗原性不会产生影响。

用含霍乱毒素A_2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的 克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2 /B亚基基因的原核表达载体 ,为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法扩增出P30基因片段后 ,克隆入含有霍乱毒素A2 /B亚基基因的表达质粒pUAB0 2 4 ,在大肠杆菌JM10 9(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS -PAGE电泳及Westernblotting进行检测鉴定。 结果 电泳证明质粒构建正确 ,SDS -PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带 ,Westernblotting进一步证实该条带为P30 -CTA2 /B融合蛋白。结论 表达载体pUAB0 2 4 -P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30 -CTA2 B。

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的:克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法:从感染HSV-1F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30 cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30 cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1形成pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果:成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1F株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论:成功克隆出UL30 cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。

抑癌基因TIP30真核表达载体的构建和序列测定

目的构建抑癌基因TIP30的真核表达载体并进行序列测定。方法从人正常肾组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增TIP30的基因编码区序列,将PCR片段定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),并进行序列测定。结果提取人正常肾组织总RNA并经RT-PCR扩增后,产生特异性条带,位置在800bp左右,与预期相符;pcDNA3.1-TIP30用BamHI和EcoRI双酶切后产生2条带,均与预定位置相符;TIP30基因编码区序列与GenBank登录号AF039103文献报道的序列同源性为100%,目的基因与载体正确连接。结论成功克隆了抑癌基因TIP30的基因编码区序列,并构建了其真核表达载体pcDNA3.1-TIP30,为后续转染和表达的实验研究奠定了基础。

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

目的对苦瓜中MAP30基因进行克隆,并采用基因工程手段构建植物表达载体。方法从苦瓜中提取基因组DNA,根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计1^ST-S、1^ST-A、2^nd-A 3个引物,并添加了SEKDEL序列、Kozak序列和组氨酸标签,采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量在800-1 000 bp之间的片段,回收克隆测序。结果克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,对PCR检测阳性的质粒进行测序分析,目的基因已成功连接到pBI121载体上,构建成植物表达载体。结论成功构建MAP30基因植物表达载体,为将MAP30基因转入番茄、烟叶中,进一步大量获得MAP30奠定基础。

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

首先提取苦瓜的基因组DNA,然后根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计一对特异引物MAP301,MAP302,并增添特异定位于内质网的小肽Kozak序列。采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量为800bp左右的片段,回收克隆测序,结果表明,克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,将阳性克隆进行酶切,获得的目标片段与用同样酶切所获得的植物表达载体pEV1和pEV2大片段连接,酶切鉴定重组子构建成特异表达于果实的载体。

马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大。最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性。为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30。通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定。结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。

里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建

将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-ManΙ经EcoRΙ、绿豆芽核酸酶、HindⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T7启动子以及信号肽OmpT序列的分泌型表达载体pTOO2连接,将质粒pGEM-ManΙ中的β-甘露聚糖酶基因连接在pTOO2质粒信号肽OmpT之后,构建成表达载体pTOO2-ManΙ。将表达载体pTOO2-ManΙ转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,克隆转化子,pCR测序,结果获得了β-甘露聚糖酶编码的成熟肽cDNA,其序列与GeneBank报道完全一样。并从该克隆转化的大肠杆菌的周质中检测到了β-甘露聚糖酶的活性同时,证明β-甘露聚糖酶基因在分泌型过程中得到正确加工。

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30原核表达载体构建

苦瓜作为药食同源的植物,含有许多活性成分,其中核糖体失活蛋白MAP30是近年来研究较多的一种。根据Genbank中MAP30序列,采用PCR技术,从苦瓜基因组DNA中扩增出该基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-MAP30,经克隆载体转化菌液PCR鉴定,结果显示成功构建MAP30的原核表达载体。

苦瓜MAP30基因的毕赤酵母表达载体构建及重组菌株的筛选

目的:从苦瓜中克隆MAP30全长基因,并将该基因连接至表达载体pPIC9中,建立酵母菌落PCR筛选方法。方法采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取基因组DNA,设计特异性的引物,通过PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9中。重组载体转化GS115菌株,运用菌落PCR鉴定重组菌株。结果:基因测序表明,该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9α-factor分泌信号下游,同源性分析表明该基因与GeneBank(AF284811)的核苷酸同源性达99.9%,氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。结论:成功地克隆了MAP30全长基因,并构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体,并获得了整合菌株,为下一步研究奠定了基础。

甘肃汉族人群溶质载体家族30成员8基因多态性与2型糖尿病的相关性

目的探讨甘肃汉族人群溶质载体家族30成员8(SLC30A8)基因多态性与2型糖尿病的相关性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法,随机选取甘肃116例2型糖尿病患者(2型糖尿病组)及80例体检者(对照组)进行SLC30A8基因rs13266634C/T单核苷酸多态性检测,比较两组间基因型频率和等位基因频率及相关性;以稳态模型胰岛B细胞分泌功能指数评估胰岛B细胞功能,胰岛素抵抗指数评估胰岛素抵抗。结果 2型糖尿病组CC基因型频率明显高于对照组,而TT基因型频率低于对照组。2型糖尿病组CC基因型频率与TT基因型频率比较,有显著性差异(P<0.01);C风险等位基因患2型糖尿病的风险是T等位基因者的2.40倍,有显著性差异(P<0.01);CC基因型的胰岛B细胞分泌功能指数、空腹胰岛素显著低于TT基因型,差异有统计学意义P<0.05)。CC、CT、TT3种基因型的胰岛素抵抗指数,差异无统计学意义。结论甘肃汉族人群存在SLC30A8基因rs13266634多态性,rs13266634多态性与甘肃汉族2型糖尿病的发生相关;SLC30A8基因rs13266634的C等位基因可能是2型糖尿病的风险等位基因。SLC30A8基因增加2型糖尿病的易感性可能与胰岛B细胞功能下降有关,与胰岛素抵抗无明显相关性。

溶质载体家族30成员8基因rs13266634C/T多态性与甘肃东乡族、汉族2型糖尿病的关系

目的探讨溶质载体家族30成员8(SLC30A8)基因rs13266634C/T单核苷酸多态性在甘肃东乡族、汉族人群中的分布及其与2型糖尿病(T_2DM)的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测甘肃东乡族、汉族T_2DM患者组(T_2DM组)和体检对照者组(对照组)SLC30A8基因rs13266634C/T多态性。结果 rs13266634C/T的CC基因型频率、C等位甚因的频率在东乡族和汉族T_2DM组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。东乡族C等位基因携带者患T_2DM的风险是T等位基因的1.62倍;汉族C等位基因携带者患T_2DM的风险是T等位基因的1.54倍。结论甘肃东乡族和汉族人群均存在SLC30A8基因rs13266634C/T位点变异,C等位基因是其风险等位基因,SLC30A8基因可能是甘肃东乡族和汉族人群T_2DM的易感基因。

红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana)MpMYB30基因的克隆及表达载体的构建

MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一,在转录调节中起着多方面的重要作用。实验利用RACE技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中获得了MpMYB30的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体中。结果表明,该基因全长为1661bp,推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高,命名为MpMYB30,其N端含有2个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的MpMYB30蛋白的分子式为C1790H2794N538O584S12,相对分子质量为41579.8ku,等电点为6.30,不存在信号肽和跨膜区域,蛋白质结构以α螺旋为主。利用XbalⅠ和SacⅠ对重组质粒进行酶切,并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上,通过抗性筛选和PCR酶切检测,证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA-S1300+上。

前列地尔脂微球载体制剂治疗老年UA30例观察

不稳定型心绞痛(UA)是介于稳定型心绞痛和急性心肌梗死(AMI)之间的一组心肌缺血综合征,若不及时治疗,极易发展为AMI,甚至心源性猝死。近两年,我们应用前列地尔脂微球载体制剂(Lipo PGE_1)治疗老年UA,取得较好疗效。现报告如下。 临床资料:按照WHO制定的缺血性心脏病命名及诊断标准,本文UA患者60例,随机分为两组,治疗组30例,男24例,女6例;年龄62～74岁,平均68岁。初发劳力型心绞痛6例,恶化劳力型心绞痛16例,自发性心绞痛7例,梗死后心绞痛1例。对照组30例,其性别、年龄、体重、血糖、血脂与治疗组具有可比性。 治疗方法:在常规治疗(肝素、β—受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、阿司匹林等)基础上,治疗组给予Lipo

靶向CD30的CAR-T细胞慢病毒转导条件优化研究

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞技术在血液肿瘤治疗领域已被广泛应用,慢病毒转导是CAR-T细胞制备的关键环节,与CAR-T细胞的质量密切相关,因此慢病毒转导过程涉及的各项参数仍需进一步优化。本研究旨在探讨携带CD30抗体序列的慢病毒转导T细胞的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、温育密度、转导前活化时间和转导体系高度对抗CD30 CAR-T细胞的影响,优化CAR-T细胞的转导条件,提高转导效率和CAR-T细胞功能。方法:采用不同的MOI、温育密度、转导前活化时间和转导体系高度等对人外周血来源的T细胞进行转导优化,转导后分别检测抗CD30 CAR-T细胞的增殖能力、转导效率、细胞存活率和体外杀伤效率等,以确定最优的T细胞转导条件。结果:MOI为1.00、1.50和3.00时转导效率和有效细胞数显著高于0.00、0.25和0.50组。在温育密度大于1.0×10^(7)个/mL时,温育密度对T细胞转导效率无影响。活化时间为72 h组细胞存活率低于80%,显著低于其他组;24、48 h的转导效率显著高于0、8、16 h组;48 h组CAR-T细胞的增殖速率显著高于24 h组。转导体系高度为0.16 mm时转导效率和增殖倍数都显著高于0.53 mm组,但对CAR-T细胞的体外杀伤效率无影响。结论:通过对CAR-T细胞功能的综合评估,确定慢病毒的最佳转导条件为MOI=1、温育密度为1.0×10^(7)个/mL、转导前活化48h、转导体系高度为0.16mm。