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斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达 被引量:2
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作者 邱宗文 张锡林 +1 位作者 王英 段文元 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第3期187-191,共5页
目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDSPAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RTPCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序... 目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDSPAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RTPCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对。根据已获得的序列和pET22b(+)载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T/A克隆,阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b(+)载体连接并转化至BL21(DE3)菌株,收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果SDSPAGE显示,经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异,但经诱导表达的阳性克隆菌株的22ku蛋白条带比另两菌株明显,免疫印迹证实,该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应。结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b(+)载体,经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应。 展开更多
关键词 斯氏狸殖吸虫 半胱氨酸蛋白酶 pet22b栽体
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人胰腺癌Hedgehog信号通路中膜蛋白受体PTCH的纯化
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作者 邵建国 许国铭 +6 位作者 屠振兴 高军 龚燕芳 许爱芳 满小华 吴红玉 金晶 《胰腺病学》 2006年第3期141-144,共4页
目的构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA,经RT-PCR扩增出PTCH基因,经纯化、回收目的基因PTCH,将其插入表达载体pET22b,转化E.ColiBL21-CodonPlus(TM)-RP,构建重组质粒pET22b/PTCH,I... 目的构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA,经RT-PCR扩增出PTCH基因,经纯化、回收目的基因PTCH,将其插入表达载体pET22b,转化E.ColiBL21-CodonPlus(TM)-RP,构建重组质粒pET22b/PTCH,IPTG诱导表达融合蛋白,免疫印迹进行鉴定,Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白。结果从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789bpPTCH目的片段,成功构建重组质粒pET22b/PTCH,并诱导表达目的蛋白;经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白。结论成功构建了重组质粒pET22b/PTCH,并获得纯化的融合蛋白,为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具。 展开更多
关键词 HEDGEHOG 信号传递 胰腺肿瘤 PTCH基因 pet22b载体
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Ficolin 3的表达、纯化及其对RAW264.7巨噬细胞的活化作用 被引量:2
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作者 郭江涛 曹旭晴 王志军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期677-680,共4页
目的构建人ficolin-3基因的原核表达载体在大肠杆菌中表达后纯化,检测可溶性His-ficolin在诱导巨噬细胞系RAW264.7活化中的作用。方法从人外周血单个核细胞cDNA中扩增人ficolin-3基因的cDNA序列,将其插入pET22原核表达载体中,酶切鉴定... 目的构建人ficolin-3基因的原核表达载体在大肠杆菌中表达后纯化,检测可溶性His-ficolin在诱导巨噬细胞系RAW264.7活化中的作用。方法从人外周血单个核细胞cDNA中扩增人ficolin-3基因的cDNA序列,将其插入pET22原核表达载体中,酶切鉴定并测序验证重组质粒pET22b-ficolin 3后,在大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化His-ficolin 3。以His蛋白为对照,利用流式细胞术检测不同浓度可溶性His-ficolin 3对RAW264.7细胞吞噬鸡红细胞能力的影响,利用ELISA检测His-ficolin 3对RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α的影响。结果酶切鉴定获得预期目的片段,测序证实重组质粒pET22b-ficolin 3构建成功。SDS-PAGE提示相对分子质量(Mr)33 000处有可溶性目的蛋白His-ficolin 3表达,His柱纯化后产物纯度在90%以上。Western blot法检测证实纯化产物为His-ficolin 3。和His蛋白相比,His-ficolin 3对RAW264.7细胞的吞噬能力具有剂量依赖性,即His-ficolin3浓度越高,吞噬能力越强;此外,His-ficolin3能显著诱导RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α等炎性细胞因子。结论成功构建了pETb-Ficolin 3重组载体并获得了纯度为90%以上的His-ficolin 3。His-ficolin 3能够显著促进巨噬细胞RAW264.7的活化。 展开更多
关键词 pet22b 原核表达 RAW264 7巨噬细胞 细胞吞噬作用
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儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化 被引量:2
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作者 李付鸾 谢忠平 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2007年第1期17-19,共3页
目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用... 目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用IPTG诱导表达,并用亲和色谱纯化COMT。结果经测序分析成功构建了融合表达质粒Pet22b+-COMT。COMT基因在E.coli BL21(DE3)中表达相对分子质量约为28000的蛋白质,纯化后,COMT蛋白的纯度大于90%。结论COMT基因在原核中得到良好的表达,得到了纯度较高的蛋白质,为酶学活性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 儿茶酚胺氧位甲基转移酶 pet22b^+ B121(DE3)
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脆性X智力低下蛋白的克隆表达与纯化
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作者 刘剑 邹柯 +1 位作者 朱宁 沈岩 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2008年第7期692-695,共4页
目的探讨脆性X智力低下蛋白(FMRP)的克隆表达与纯化条件。方法用分子克隆的方法构建重组质粒pET22b(+)-FMR1,并将其转入原核表达菌株E.coliBL21(DE3)中诱导表达;用固化Ni2+吸收色谱纯化重组FMRP,Western-blot鉴定并将纯化得到的蛋白与... 目的探讨脆性X智力低下蛋白(FMRP)的克隆表达与纯化条件。方法用分子克隆的方法构建重组质粒pET22b(+)-FMR1,并将其转入原核表达菌株E.coliBL21(DE3)中诱导表达;用固化Ni2+吸收色谱纯化重组FMRP,Western-blot鉴定并将纯化得到的蛋白与已知的RNA片段进行结合反应。结果成功构建了重组表达质粒pET22b(+)-FMR1,在E.coliBL21(DE)中表达出相对分子质量约79 000的蛋白;该蛋白为FMRP,且可与特定RNA相互作用。结论在原核系统中表达得到了纯度和活性都较为理想的FMRP蛋白,为相关功能性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 脆性X智力低下蛋白(FMRP) pet22b(+) BL21(DE3) RNA结合
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抗黄曲霉毒素B1单链抗体在大肠杆菌中的表达及优化 被引量:2
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作者 杨炼 张艳红 +3 位作者 丁虎生 王丽云 陈卫 张灏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期880-888,共9页
【目的】继杂交瘤技术后,重组抗体技术是新一代的抗体制备技术。然而如何用原核系统中较多地表达具有生物活性的单链抗体,避免包涵体形成仍是一个需要探讨的问题。【方法】将目的基因scFv-H4克隆到载体pET22b上,分别转入大肠杆菌BL21(D... 【目的】继杂交瘤技术后,重组抗体技术是新一代的抗体制备技术。然而如何用原核系统中较多地表达具有生物活性的单链抗体,避免包涵体形成仍是一个需要探讨的问题。【方法】将目的基因scFv-H4克隆到载体pET22b上,分别转入大肠杆菌BL21(DE3)和Origami(DE3)中,通过改变诱导温度和IPTG浓度,比较具有生物活性的蛋白量以及包涵体的量。【结果】在BL21(DE3)中,pET22b能产生大量表达scFv-H4,而BL21(DE3)的含有trxA和gor双突变的衍生菌Origami(DE3)表达的scFv-H4的总量较少,但是具有生物活性的蛋白量较多(35 mg/L培养物),具有生物活性的蛋白比例也较BL21(DE3)高。另外IPTG的浓度对scFv-H4表达没有显著影响,而较高的诱导温度会促使表达的蛋白形成包涵体。【结论】在较低的温度下,pET22b能在Origami(DE3)能较好地表达具有生物活性的scFv-H4,减少包涵体的比例,为后续的抗体性质研究和改造奠定了基础。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素 单链抗体 表达 B121(DE3) Origami(DE3) pet22b
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