抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达

目的:构建单链抗体scFv3的原核表达载体pET28a-scFv3并诱导表达,纯化并检测表达产物的免疫抗原性。方法:用PCR扩增抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3基因,构建pGEM-scFv3重组质粒并测序。将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化,用间接ELISA检测纯化的单链抗体scFv3的免疫抗原性。结果:酶切和测序证实得到的scFv3基因序列正确。间接ELISA检测表明,纯化获得的scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建了pET28a-scFv3原核表达系统并获得纯化的scFv3蛋白。表达产物具有良好的抗原性,为进一步研究该单链抗体在抗GBM抗体病中的治疗作用奠定了基础。

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.

肠道病毒71型VP3结构蛋白的原核表达

目的利用大肠杆菌原核表达系统优化表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP3结构蛋白,为后续单克隆抗体制备及检测试剂盒研发提供前期基础。方法采用PCR方法扩增EV71病毒VP3基因,将其插入表达载体pET28a(+),构建pET28a-VP3重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,分别在25℃、37℃下经IPTG诱导表达,重组表达的蛋白产物经凝胶电泳初步分析,比较不同温度诱导表达的蛋白产物。结果成功构建pET28a-VP3重组质粒,不同温度下诱导表达的蛋白产物在30.5 k Da左右位置均出现目的条带;37℃下诱导表达的蛋白超声破碎并离心后,目的蛋白基本位于沉淀中,而25℃诱导表达的蛋白产物有少量目的蛋白溶解于上清液中。结论在25℃或37℃下均能利用大肠杆菌原核表达系统有效表达EV71病毒VP3蛋白;37℃诱导时蛋白可融性表达低,目的蛋白获取效率较高。

玉米APX基因的克隆及其原核表达研究

为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗盐性明显高于对照菌株BL21(pET28)且其抗NaCl的临界浓度为0.6 mol/L,这为后期对作物的抗逆研究提供了科学依据。

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b(+)中,构建原核表达质粒pET28b(+)-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。

耐高温葡萄糖异构酶重组菌发酵与转化条件研究

耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温度28℃,诱导剂终浓度0.1 mmol/L,发酵培养基添加5 mmol/L Mn^(2+)的最优产酶发酵条件;将最优转化体系放大,包括20 g/L湿菌体、10 mmol/L Mn^(2+)和200 g/L底物,于95℃和pH 7.5条件下生物转化4 h,D-果糖得率高达57.34%。该工艺具备一步法生产F55型高果糖浆的可能性,可简化后续浓缩分离等步骤,为进一步使用食品安全的表达系统生产F55型高果糖浆提供理论依据。

耐高温葡萄糖异构酶的全细胞固定化条件研究

对三羟甲基磷交联Thermus oshimai葡萄糖异构酶重组菌的固定化工艺进行研究。确定所用硅藻土载体粒径36.8μm、聚凝剂聚乙烯亚胺分子质量为70 000 Da、交联剂合成前体为四羟甲基硫酸磷;运用最优的固定化条件:0.3 g硅藻土、5 mmol/L Mn^(2+)、0.12%(体积分数)聚乙烯亚胺絮凝1 h、1.5%(体积分数)三羟甲基硫酸磷交联1.5 h,所制备的固定化细胞酶活可达138.4 U/g。应用该催化剂于85℃和1 100 mmol/L D-葡萄糖底物条件下连续催化10批次,催化剂仍保留91%以上酶活,D-果糖转化率始终维持在51.7%以上。该工艺可以连续生产高果糖浓度高果糖浆,有效简化后续分离提取工艺,为进一步使用符合食品工业要求的表达系统连续制备高果糖浆奠定基础。

T4噬菌体32蛋白的表达、纯化及鉴定

目的构建T4噬菌体32蛋白的原核表达质粒T4—32-pET28b，并表达、纯化和鉴定重组目的蛋白。方法以T4噬菌体DNA基因组为模板，PCR扩增得到32蛋白基因片段，定向克隆到原核表达载体pET28b中，转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中，用IPTG诱导表达目的蛋白，然后进行镍柱纯化和G-25脱盐，获得纯化目的蛋白，并进行核酸酶和细菌基因组污染检测及结合DNA单链能力检测。结果构建的T4-32-pET28b质粒经酶切及测序鉴定正确，在BL21（DE3）成功表达了T4-32蛋白，经镍柱和脱盐纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论成功构建了T4噬菌体32蛋白的原核表达载体T4—32-pET28b，并实现高表达和纯化了目的表达产物。