细粒棘球绦虫EgA31重组蛋白的抗原表位分析预测

根据GenBank中细粒棘球绦虫EgA31序列(GenBank登录号为AF067807)设计引物,以细粒棘球绦虫mRNA为模板,RT-PCR扩增EgA31基因,将其克隆入pUCm-T载体,转化大肠埃希菌(E coli)DH5α,筛选阳性克隆,经BamH I、Sac I双酶切和PCR鉴定,获得阳性重组质粒pUCm-T/EgA31,并将测序正确的片段连接表达载体,成功构建重组质粒pET30a-EgA31。经序列分析和同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞和T细胞表位分析,结果表明PCR扩增的特异条带为636 bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为100%。编码产物B细胞和T细胞联合表位预测,氨基酸区域可能在32～79、79～95、105～124和141～154位。

重组酶Cre基因在大肠杆菌中的高效表达及其一步纯化和活性检测

为了实现DNA重组酶Cre在体外的应用,以pET-30a高效表达载体为基础构建了pTE30-Cre质粒.将此质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导的Cre基因的高效表达.对表达出的Cre重组酶蛋白进行镍离子鳌合法一步纯化,并以带有两个同向loxP位点的质粒为底物,对纯化出的Cre酶进行活性检测.该实验为Cre酶的体外应用奠定了基础.

苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因的克隆及其原核表达

MxMYB1是苹果属小金海棠MYB类转录因子。MxMYB1含1个重复序列及MYB蛋白特有的氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确,未出现碱基突变及移码现象。1mmol/LIPTG诱导2h后,在预期的蛋白分子量38kD处出现1条表达加强的蛋白条带,而未经诱导的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。

新等位基因人类白细胞抗原B*15:133的鉴定及其原核表达

背景:国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的:在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法:利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论:发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B*15:18:01在第419位相差一个核苷酸,C->T,即Codon116位TCC->TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B*15:133。血清学表达B71(70)抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a(+)-B*15:133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B*15:133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a(+)-B*15:133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。

金丝桃素合成酶基因的克隆及其表达

自然条件下金丝桃素在植物中的含量较低且不稳定,提取工艺受其他物质的影响较大,在一定程度上限制了金丝桃素在医药、食品等领域的应用。为了研究金丝桃素合成途径并实现其体外转化,以贯叶连翘愈伤组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长cDNA,即Hyp基因。将该基因克隆到原核表达载体pET30a中,成功构建金丝桃素合成酶表达载体pET30a-Hyp,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。含有重组质粒的克隆在IPTG诱导下,表达出金丝桃素合成酶融合蛋白,利用Ni柱纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE分析,结果Hyp基因得到了高效表达,大小约为20 kD。

乙醛脱氢酶基因表达载体的构建及表达条件筛选

通过PCR扩增得到酿酒酵母乙醛脱氢酶基因ALDH长约1.6 kb的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,并将该序列与pET30a(+)载体相连,得到pET30a-ALDH重组质粒,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达;对含有pET30a-ALDH重组质粒的工程菌进行表达条件分析,发现当异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为28℃、诱导表达时间为6 h时,ALDH酶相对活性达到最高,为30.2 U/m L。

截短NDVF蛋白的原核表达

根据NDV LaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT-PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a(+)原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导入BL21(ED3)感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS-PAGE和Westem-blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31.1 kDa和27.9 kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Western blot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pETF780和pET-F760,并获得了高效表达,通过Western blot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。

人TLR1胞外段的克隆及测序分析

目的构建人Toll样受体1(TLR1)胞外段原核表达质粒。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)mRNA中扩增人TLR1胞外区cDNA;将扩增的目的基因与原核表达载体pET30a(+)质粒经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后连接,转化E.coli BL21(DE3),筛选转化子,菌落PCR及测序验证克隆序列的正确性。结果测序结果表明,成功构建pET30a(+)-TLR1胞外区基因重组质粒,并转化感受态E.coli BL21(DE3)。结论 TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确克隆,为TLR1信号通路的进一步研究打下了基础。

重组胶原酶Bacillus cereus ColM13的酶学及结构特性分析

以前期成功构建出降解胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21为出发菌,对工程菌表达纯化出的重组胶原酶(ColM13)的酶学性质进行分析。通过研究温度、pH、抑制剂对其的影响,得出ColM13的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0;在20~55℃和pH6.0~9.0范围内有良好的稳定性;金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylenebis(oxyethylenenitrilo tetraacetic acid,EGTA)对ColM13有显著的抑制作用。采用紫外光谱(ultraviolet and visible spectrum,UV)、差示量热扫描(differential scanning calorimeter,DSC)、荧光光谱(FS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)对骨胶原蛋白及其酶解产物进行结构特性分析,分析可知酶解作用使骨胶原蛋白的三股螺旋结构遭到破坏,释放出大量的游离氨基酸。酶解后胶原蛋白的肽链上-NH_2^+-相互排斥减弱,疏水氨基酸残基作用增强,具有更高的热稳定性。与B.cereus MBL13-U分离纯化出的胶原酶(BSC)相比,ColM13处理的胶原蛋白的降解效果更明显。

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。