多次小剂量pEgr-IFN-γ基因-放射治疗的抑瘤效应及其机制的研究

目的:探讨多次小剂量pEgr-IFN-γ基因-放射治疗对接种B16黑色素瘤小鼠的抑瘤效应及其免疫学机理。方法: 肿瘤局部注射脂质体包裹的重组质粒pEgr-IFN-γ后36 h,接受不同剂量X射线照射,观察各组小鼠照后不同时间肿瘤生长速 率和平均存活时间。照后第3天用RT-PCR法检测瘤内IFN-γ转录水平,ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ含量,并于照后第15 天检测小鼠部分免疫学指标。结果:照后第9-15天,4次(质粒+5Cy)组小鼠肿瘤生长速率明显低于质粒+20 Gy组,且平 均生存时间明显延长;照后第3天质粒+20 Gy组瘤内IFN-γ转录水平明显高于质粒组,照后第1,3天血清中IFN-γ含量明显 高于质粒组和对照组,照后第15天脾脏NK细胞毒活性、IL-2和IFN-γ分泌活性均明显高于20 Gy照射组。结论:多次小剂 量基因-放射治疗的抑瘤效应优于单次大剂量基因-放射治疗。基因-放射治疗组可能通过诱导瘤内IFN-γ表达增强,使血液中 IFN-γ浓度升高,从而提高荷瘤机体免疫功能和抗肿瘤能力。

疏水类弹性蛋白多肽的克隆表达及相变特性分析

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)作为新型温敏生物材料,在药物递送、组织工程和蛋白质分离纯化领域具有广阔的应用前景,精确控制快速生物合成具有特定相变特性的ELPs至关重要。利用质粒重建递归定向连接技术,成功构建以缬氨酸为客座氨基酸的重组质粒pET28-ELP 25、pET28-ELP 50和pET28-ELP 100,分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经自诱导培养基的培养,SDS-PAGE结果表明,ELPs在大肠杆菌体系中实现了胞内可溶过量表达,表达量约占胞内全细胞蛋白的30%以上。利用可逆相变循环法(inverse transition cycling,ITC)进行分离纯化,仅需3轮ITC获得电泳纯ELP 25、ELP 50和ELP 100。热比浊法测定相变温度,分析显示ELPs的相变温度与多肽浓度、离子强度和多肽分子量均呈负相关,为进一步重组克隆表达特定相变特性的温敏多肽生物材料奠定理论基础。

pEgr-IFNγ基因-放射治疗对荷瘤小鼠抑瘤效应的研究

探讨pEgr-IFNγ基因-放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜照射剂量和质粒注入量。观察不同剂量X射线照射及瘤内不同量pEgr-IFNγ重组质粒注入,基因-放射治疗在接种B16黑色素瘤小鼠体内抑瘤效应的差异,并用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测各组小鼠外周血IFNγ含量。结果表明,质粒注入后接受20Gy X射线照射组照后3—27d,肿瘤生长速率明显低于2Gy和10Gy照射组(p<0.001),且小鼠平均生存时间明显延长(p<0.001)。质粒注入量为20μg或30μg的联合治疗组照后3—27d,肿瘤生长速率明显低于注入量为10μg的联合治疗组(p<0.05—0.001),且平均生存时间明显延长(p<0.01)。基因-放射联合治疗组受照射后第1天和第3天外周血IFNγ含量明显高于单纯基因治疗组均为(p<0.05)和对照组,分别为(p<0.01,p<0.05)。结果显示,pEgr-IFNγ基因-放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜照射剂量为20Gy,质粒注入量为20μg;联合治疗组可能通过诱导瘤内IFNγ基因表达增强,使血液中的IFNγ浓度升高,进而增强机体免疫功能和抗肿瘤能力。

轮状病毒荧光定量PCR标准品的构建

采用MA104细胞系培养和T载体克隆技术,在轮状病毒结构蛋白VP4基因序列中设计合成引物,经过PCR扩增后将特异性产物与pMD-19-T载体连接,对获得的轮状病毒重组质粒标准品进行酶切鉴定和测序分析。利用常规PCR和荧光定量PCR方法对获得的重组质粒标准品进行特异性和灵敏度指标的检验。结果表明,将构建的重组质粒作为标准品制备标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-4.015,R2=0.991);荧光定量PCR熔解曲线分析表明,85.8℃的PCR产物是轮状病毒VP4基因序列的特异性产物,该标准品具有轮状病毒特异性;同时,所制备的重组质粒标准品在荧光定量PCR检测中具有较大的线性范围(5×101~5×1010拷贝/μL),每个梯度PCR反应最低可以检测到50拷贝的重组质粒,因而采用该标准品进行荧光定量PCR分析具有较高的检测灵敏度;此外,该重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性,3次独立实验的变异因数Cv<1.5%。构建的重组质粒标准品可以用做环境水体中轮状病毒的荧光定量PCR标准品。

带有酪氨酸羟化酶基因的pHSV_1TH质粒构建

为高效表达酪氨酸羟化酶（ＴＨ）基因，采用分子克隆技术，构建以单纯疱疹病毒Ⅰ型－胸苷激酶（ＨＳＶ＿１－ＴＫ）基因为启动子的ＴＨ基因的重组质粒，以了解在ＨＳＶ＿１－ＴＫ启动子作用下ＴＨ基因的表达水平。为巴金森病基因治疗提供手段。

pcEgr-IFNγ基因治疗联合放射治疗抗肿瘤作用的实验研究

目的 探讨pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗对移植黑色素瘤B16小鼠的抗肿瘤作用及其免疫学机理。方法 肿瘤局部注射脂质体包裹的pcEgr IFNγ重组质粒后 36h ,接受 2 0GyX射线照射 ,观察放疗后不同时间肿瘤大小 ,放疗后 3d瘤内IFNγ转录水平和 15d部分免疫学指标。结果pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗后第 3～ 15天 ,肿瘤生长速率明显低于单纯照射组 ,照后第 9～ 15天明显低于单纯基因治疗组和空质粒对照组 ;治疗后第 3天 ,pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗组瘤内IFNγ表达水平明显高于单纯基因治疗组 ;脾脏NK细胞毒活性、IL 2和IFNγ分泌活性均明显高于单纯放疗组和单纯基因治疗组。结论 pcEgr IFNγ基因 放射联合治疗抗肿瘤作用明显优于单纯放疗和单纯基因治疗组 ,其机理可能与放疗诱导瘤内IFNγ基因表达增强 ,激活荷瘤机体抗肿瘤免疫功能有关。

构建含有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因腺病毒并体外检测

目的构建载有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因片段的腺病毒载体，并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况。方法提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc—GFP质粒，测序成功后包装构建AdS—PDC316-CD40-IgG2aFc—GFP，转染293细胞。出毒后大量复制病毒并纯化，测定病毒滴度，体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的蛋白情况并检测目的蛋白表达量。结果成功构建了质粒及病毒，体外感染显示该病毒能有效的感染细胞并表达蛋白（荧光显示），检测目的蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加。当病毒浓度增加到一定程度时目的蛋白表达趋于无明显差异性。结论构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内，分泌表达目的蛋白是可行的，为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定了基础。

适应H_9亚型禽流感病毒增殖的重组R-MDCK细胞系的建立

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。