辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母单杂交pGADT7载体构建

辣椒是我国重要的经济作物之一,但番茄斑萎病毒(TSWV)极易造成其巨大的生产损失,亟需有效的防治策略。前期研究发现,辣椒转录因子CaWRKY39在TSWV侵染下特异性高表达,推测其可能在辣椒抗TSWV中发挥重要作用。本研究从辣椒‘萧新19’叶片中克隆了CaWRKY39基因,并对其进行生物信息学分析,结果表明,CaWRKY39的CDS全长为1 035 bp,编码一个由344个氨基酸组成、相对分子量为38 570.53 Da、理论等电点为9.59的稳定疏水蛋白,该蛋白二级结构和三级结构主要由无规则卷曲构成,占比为60.76%。系统进化分析发现CaWRKY39蛋白与棉花GhWRKY39蛋白亲缘关系最近,表明两者功能可能具有相似性。为进一步验证CaWRKY39对相关抗性基因的靶向调控作用,采用RT-PCR技术扩增CaWRKY39基因CDS序列,利用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切,并通过无缝克隆的方法成功构建了酵母单杂交表达载体pGADT7-CaWRKY39。本研究结果可为深入研究CaWRKY39转录因子参与辣椒抗TSWV病毒的分子机理提供技术支持和参考。

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

目的 构建一个含 16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库。方法 设计合成编码 16肽的随机DNA片段 ,PCR扩增随机DNA片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH RP并检验其库容。结果 扩增获得编码 16肽的随机DNA片段 ,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,与GAL4AD形成融合蛋白 ,其库容为 1 2 8× 10 7。

酵母双杂交随机环肽库的构建、鉴定与扩增

目的 :构建含 16个氨基酸的酵母双杂交随机环肽库。方法 :以PCR扩增人工合成的随机DNA模板 ,经BamHI和EcoRI酶切后 ,克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机环肽库并检验其库容及随机性 ,扩增、抽提并纯化酵母双杂交环肽库质粒。结果 :构建了酵母双杂交随机环肽库 ,库容为 1.2 8× 10 7,氨基酸分布与理论频数无显著差异 ,并扩增获得大量高纯度的环肽库质粒。结论 :成功地构建酵母双杂交随机环肽库 ,并获得大量高纯度的环肽库质粒。

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16~421bp的片段和SCR第1876~2068bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。