碱性果胶酶基因在毕赤酵母中的非诱导表达

为了使碱性果胶酶基因能在毕赤酵母中获得非诱导表达,利用聚合酶链式反应(PCR)技术,以实验室保藏菌株毕赤酵母EIM-60基因组为模板,设计引物扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的基因PGL,大小约为1 206 bp。酶切后连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA的多克隆位点上,成功构建了重组载体pGAPZαA-PGL,将其电转化入毕赤酵母GS115进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达,分子量为44.3 ku。通过考马斯亮蓝法蛋白浓度试剂盒测定其蛋白含量为0.430 g/L,通过BandScan软件分析目的蛋白占总蛋白的41.4%,即0.178 g/L。

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。