pGEX载体表达马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的最佳条件

通过聚合酶链式反应 (PCR) ,扩增出马立克氏病病毒特超强毒 (vv +MDV) 648株囊膜糖蛋白gI基因 ,并将该基因按正确的阅读框 (ORF)克隆到表达性载体质粒pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。重组质粒 (pGEX gI)经氯化钙转化宿主菌BL2 1 ;通过建立重组菌生长时间与OD60 0 值间的关系曲线 ,以及对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度等条件的摸索 ,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)判定GST gI融合蛋白的最佳表达条件 ,并经蛋白质印迹试验 (WesternBlotting)对表达产物进行了验证。将表达产物免疫小鼠 ,所得抗血清能与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)在间接免疫荧光试验 (IFA)中 ,呈较强的细胞膜荧光着色。实验结果表明 :IPTG的最佳浓度为 0 2～ 0 5mmol L ;最适的诱导时期为重组菌生长对数中期 ;温度对表达几乎没有影响。

pGEX-L系列表达载体的构建

对ｐＧＥＸ系列表达载体的多克隆位点（ＭＣＳ）进行了改造，改造前ＭＣＳ上仅有ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＩ三个酶切位点。改造后的ＭＣＳ上含有８个酶切位点，它们分别是ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＡｖａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌⅡ、ｐｓｔⅠ、ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ，改造后构建形成的ｐＧＥＸ－Ｌ系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。

单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达

目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lmo)溶血素(Hemolysin,hly)蛋白,以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用。方法本文应用Primer Premier 5.00设计引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以前期合成构建的pMD18-T-hly质粒为模板,通过PCR方法扩增出Lmo 0586株溶血素基因。相应酶切后,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建pGEX-6p-hly重组质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及免疫印记分析。结果PCR体外扩增hly基因产物大小约为1 624bp,成功构建了重组表达质粒pGEX-6p-hly;SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku,重组蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的20.8%;Western免疫印记表明具有良好的反应原性。结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,同时该蛋白具有特异的抗原反应性,为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础。

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1.方法应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力.结论成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.

yC_(16)基因在Escherichia coli中的表达及表达产物的纯化

ｙＣ１６（ｃＤＮＡ，２．９ｋｂ）是果蝇ｙｅｍａ基因的转录片段。为制备ｙＣ１６编码蛋白作为免疫原，本实验用ＧＳＴ融合基因表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ在Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中合成该基因的蛋白，并与谷胱苷肽－ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合形成融合蛋白。结果由裂解细菌所得到的融合蛋白为水溶性，并且可以在非变性的条件下，通过亲和层析作用在固定化的谷胱苷肽上加以纯化，然后再利用具有识别特异位点的蛋白水解酶——凝血酶或凝血因子Ｘａ的切割作用，将融合蛋白中的ＧＳＴ成分除掉。实验结果表明，使用ｐＧＥＸ载体合成克隆基因多肽，是一种有效而可靠的方法，步骤简单。